黎穎莉 Tomoyuki-Inoue Fumihiko-Takamatsu Naoyuki-Maeda Yuichi-Ohashi Kohji-Nishida

角膜緣干細(xì)胞和口腔黏膜上皮細(xì)胞已被成功用于眼表再生醫(yī)學(xué)治療嚴(yán)重眼表疾病[1-4]。目前，眼表重建研究多使用角膜緣干細(xì)胞在3T3飼細(xì)胞層上培養(yǎng)形成復(fù)層上皮后進(jìn)行移植。然而，治療中使用的小鼠3T3成纖維細(xì)胞具有給患者傳染鼠類疾病的風(fēng)險。最近有研究表明[5-6]，人類胚胎干細(xì)胞與小鼠飼細(xì)胞共培養(yǎng)后表達(dá)小鼠異種抗原Neu5Gc，并能誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。因此，需要尋找一種安全有效的人來源的飼細(xì)胞替代小鼠3T3細(xì)胞。有研究表明，人類皮膚成纖維細(xì)胞具有維持角膜緣干細(xì)胞和口腔黏膜上皮的干細(xì)胞生長及保持上皮細(xì)胞生物特性的能力，是一種有望成為替代小鼠3T3細(xì)胞的飼細(xì)胞[7-8]。然而，在體外培養(yǎng)的正常人類皮膚成纖維細(xì)胞的有限增殖能力增加了工作量和生產(chǎn)成本，阻礙了人皮膚成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。此外，飼養(yǎng)層細(xì)胞很容易混雜到細(xì)胞片成品中，造成再生細(xì)胞片污染。我們曾創(chuàng)建過一種可去除的飼細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞片的方法[9]，并通過研究表明這種方法通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建出了永生化、可標(biāo)記、可去除的飼細(xì)胞。在本研究中，我們的目標(biāo)是通過轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)建一支永生化、可標(biāo)記、可去除的人源性飼細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料絲裂霉素C(mitomycin C,MMC;Kyowa Hakko,Tokyo,日本)；I型膠原凝膠(Collagen Gel Culturing Kit,Nitta Gelatin,Osaka,日本)；Dispase溶液(BD Biosciences,Bedford,MA,美國)；EDTA溶液(Nacalai Tesque,Kyoto,日本)；三碘甲狀腺原氨酸 (Takeda,Osaka,日本)；氫化可的松(Kowa,Tokyo,日本)；羅丹明B (Wako,Osaka,日本)；anti-K3 (AE5)抗體 (1100；Progen Biotechnik,Heidelberg,德國),霍亂毒素(Calbiochem,La Jolla,美國)；anti-K12抗體 (1100,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,美國)和anti-P63 (4A4) 抗體(1100,Santa Cruz，美國)；Zeiss 熒光顯微鏡 (Axiovert 200M,Carl Zeiss Jena Gmbh,德國)；Applied Biosystems 7900 HT(Applied Biosystems,Foster City,美國)。ΔNp63 (Hs00978339_m1)、K3(Hs00365080_m1)、GAPDH (Hs99999905_m1)序列均購買于Applied Biosystems公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因人皮膚成纖維飼細(xì)胞參考文獻(xiàn)[9]，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體。復(fù)制缺陷型、自失活的含磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子的新霉素抗性基因(pLentiNeo)或含PGK啟動子的嘌呤霉素抗性基因(pLentiPuro) 的慢病毒載體為目的載體。將人源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(internal ribosome entry site,IRES)和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)克隆到pENTR1A載體生成pENTR-TERT-IRES-EGFP載體；單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)克隆到pENTR1A載體，生成pENTR-TK載體。轉(zhuǎn)入載體(pENTR-TERT-IRES-EGFP 或 pENTR-TK)和目的載體(pLentiNeo或pLentiPuro) 通過LR反應(yīng)生成慢病毒表達(dá)載體pLenti-TERT-IRES-EGFP-Neo或pLenti-TK-Puro。這些表達(dá)載體與pLP/VSVG(編碼VSV-G包膜蛋白)和包裝構(gòu)造pLP1、pLP2都被轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞用于生成目的慢病毒。濃縮的目的慢病毒用來感染人皮膚成纖維細(xì)胞。

TERT+EGFP+TK轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細(xì)胞通過兩個步驟創(chuàng)建。首先，將正常人皮膚成纖維細(xì)胞(KF-4009)感染pLenti-TERT-IRES-EGFP-Neo慢病毒，通過800 g·L-1G418藥物篩選，生成TERT+EGFP轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細(xì)胞。接著將TERT+EGFP轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細(xì)胞感染pLenti-TK-Puro慢病毒，通過1 g· L-1嘌呤霉素藥物篩選，生成TERT+EGFP+TK轉(zhuǎn)染的人皮膚成纖維細(xì)胞(TERT+TK-D)。創(chuàng)建的TERT+TK-D細(xì)胞置于含10 g·L-1青霉素-鏈霉素的Fibrolife S2細(xì)胞培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 更昔洛韋的細(xì)胞毒性檢測將TERT+TK-D細(xì)胞按每孔5000 個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分為四組，分別加入含0 g· L-1、 5 g· L-1、25 g· L-1、125 g· L-1更昔洛韋的培養(yǎng)液，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1～6 d。每24 h用CCK-8法檢測一次細(xì)胞活性。與平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液孔設(shè)為空白對照，最后比色以空白組調(diào)零；未用藥物處理的細(xì)胞孔為陰性對照。更昔洛韋的細(xì)胞毒作用通過細(xì)胞存活的百分比表示。

1.2.3 飼細(xì)胞層的制備TERT+TK-D細(xì)胞和3T3細(xì)胞分別用加入8 g· L-1MMC的培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)2 h。吸去MMC培養(yǎng)基，PBS洗3次，胰蛋白酶消化后，按5000個·cm-2TERT+TK-D細(xì)胞或20×103個·cm-23T3細(xì)胞密度將飼細(xì)胞接種入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和鋪有I型膠原凝膠的Transwell小室作為飼細(xì)胞層。

1.2.4 角膜緣干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)本研究采用的角膜均來自Northwest Lions Eye Bank (Seattle,WA)。角膜移植后剩余的角膜組織片撕去內(nèi)皮層后用2400 U·L-1Dispase溶液37 ℃水浴消化 1 h，再用0.2 g· L-1EDTA溶液在室溫下孵育2 min。用無菌手術(shù)鑷沿著角膜緣將上皮細(xì)胞刮下，收集的細(xì)胞用2.5 g· L-1胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)在 37 ℃ 孵育15 min。然后加入改良的角化細(xì)胞培養(yǎng)基(keratinocyte culture medium，KCM)制成上皮細(xì)胞懸液，用于克隆形成率計算和角膜上皮再生細(xì)胞片培養(yǎng)的研究。改良的KCM中主要成分：DMEM培養(yǎng)基和Ham’s F12培養(yǎng)基(DMEMF12為 31),體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清(FBS),1 nmol·L-1霍亂毒素,2 nmol·L-1三碘甲狀腺原氨酸,0.4 g· L-1氫化可的松,10 g·L-1胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑,100×103U·L-1青霉素,100 g· L-1鏈霉素。

1.2.5 克隆形成率實驗將原代角膜緣干細(xì)胞按照每孔1000個的密度接種于覆蓋有TERT+TK-D或者 3T3 飼細(xì)胞層的6孔板，共培養(yǎng)10～13 d。終止培養(yǎng)后，用體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林固定，10 g· L-1羅丹明B染色。細(xì)胞克隆形成率(colony forming efficiency,CFE)=克隆數(shù)(克隆直徑>2 mm)/接種活細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 角膜上皮再生細(xì)胞片的制備將原代角膜緣上皮細(xì)胞按每孔(100～200)×103個分別接種在含有飼細(xì)胞層的膠原凝膠涂層的Transwell小室。細(xì)胞在KCM中培養(yǎng)12 d后，置于含25 g· L-1更昔洛韋的KCM中降低液平面培養(yǎng)6～8 d，而非更昔洛韋處理對照組用不含更昔洛韋的KCM降低液平面培養(yǎng)。每2 d換液一次。

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR及定量PCR按RNeasy Mini Kit (Qiagen,Valencia,CA)試劑盒使用說明書提取各組織和細(xì)胞的總RNA。采用1st Strand cDNA Synthesis System (Origene,Rockville,MD) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄翻譯，合成PCR所需的cDNA。PCR熱循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用20 g· L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，紫外投射成像系統(tǒng)觀察，凝膠圖像分析軟件分析目的基因的相對含量。各種基因引物序列如下：肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)上游引物:5’-GCCTGAAAGATATCCCGACA-3’，下游引物:5’-TTCCATGTTCTTGTCCCACA-3’;角質(zhì)細(xì)胞生長因子2(KGF)上游引物:5’-AGGCTCAAGTTGCACCAGGCA-3’，下游引物:5’-TGTGTGTCGCTCAGGGCTGGA-3’；表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin,EPR)上游引物:5’-AGGAGGATGGAGATGCTCTG-3’，下游引物:5’-TCAGACTTGCGGCAACTCTG-3’；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)上游引物：5’-AACAATAAGGACGCAGACTT-3’，下游引物：5’-TGCAGTCTTTTTGTCTGCCG-3’；堿性成纖維細(xì)胞生長因子2(bFGF)上游引物:5’-AAGAGCGACCCTCACATCAAGCTA-3’，下游引物:5’-TACTGCCCAGTTCGTTTCAGTGC-3’；神經(jīng)型鈣黏蛋白(neural-cadherin,N-cad)上游引物:5’-CACCCAACATGTTTACAATCAACAATGAGAC-3’，下游引物:5’-CTGCAGCAACAGTAAGGACAAACATCCTATT-3’；GAPDH上游引物:5’-TCCAGAACATCATCCCTGCCTCTA-3’，下游引物:5’-TGTTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3’。各種基因的表達(dá)均使用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。定量PCR使用Taqman 熒光定量PCR方法，采用Applied Biosystems 7900 HT序列檢測儀進(jìn)行檢測、分析。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共45個循環(huán)。量化數(shù)據(jù)用GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，用序列檢測系統(tǒng)軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。最后的結(jié)果取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.8 PCR檢測飼細(xì)胞殘留實驗按QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen,Valencia,CA)試劑盒使用說明，將更昔洛韋添加組和更昔洛韋未添加組與TERT+TK-D飼細(xì)胞共培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞片組織DNA提取。長末端重復(fù)序列(long terminal repeat,LTR)是慢病毒載體的特異序列，通過慢病毒轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞時整合到TERT+TK-D細(xì)胞基因中。按照之前所述PCR條件，使用LTR特異性引物:上游引物:5’-AAGGGCTAATTCACTCCCAA-3’,下游引物:5’-TGCGTCGAGAGAGCTCTGGTTT-3’；以GAPDH作為陽性對照對提取的細(xì)胞片DNA進(jìn)行檢測。

1.2.9 免疫熒光組織化學(xué)染色收獲的上皮細(xì)胞片用Tissue-Tek OCT包埋，用于HE染色和免疫熒光組織化學(xué)染色。HE染色按照常規(guī)方法進(jìn)行，免疫熒光組織化學(xué)染色按照以下方法進(jìn)行：切片用40 g· L-1多聚甲醛在4 ℃下固定30 min，40 g· L-1脫脂牛奶PBS溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton X-100)室溫1 h封閉非特異結(jié)合，之后加入一抗：anti-K3(AE5)抗體 (1100)[10]、anti-K12抗體 (1100)[11]和anti-P63(4A4)抗體(1100)[12]，4 ℃孵育過夜。之后用PBS洗3遍×5 min，加入相應(yīng)的二抗常溫孵育1 h。再用PBS洗3遍×5 min，加DAPI染細(xì)胞核，Zeiss 熒光顯微鏡下觀察。切片加入相同濃度非特異性抗體作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法本研究中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理。采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞基因表達(dá)特征人皮膚成纖維細(xì)胞基因表達(dá)與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞相似(圖1)，兩者均表達(dá)HGF、KGF、EPR、BDNF、bFGF和N-cad。

圖1 體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞基因表型特征 D：人皮膚成纖維細(xì)胞；S：角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞；NT：陰性對照(沒有逆轉(zhuǎn)錄酶)

2.2 TERT+TK-D飼細(xì)胞生物學(xué)特性將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)導(dǎo)入人皮膚成纖維細(xì)胞，創(chuàng)建出TERT+TK-D人源飼細(xì)胞系。將TERT+TK-D飼細(xì)胞在體外連續(xù)傳代6個月(>50代)仍然保持原代人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)(圖2A)，并且在紫外燈光照射下顯示綠色熒光(圖2B)，并且保持更昔洛韋藥物致死性(圖2C)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，TK基因和LTR序列在TERT+TK-D細(xì)胞中表達(dá)，而在正常人成纖維細(xì)胞中不表達(dá)(圖2D)。經(jīng)過長時間傳代后的TERT+TK-D細(xì)胞仍保持旺盛的分裂能力(圖2E)。細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示，更昔洛韋對TERT+TK-D細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性，隨著更昔洛韋劑量的加大，細(xì)胞毒作用增強。25 g·L-1更昔洛韋組幾乎所有的細(xì)胞在6 d內(nèi)都凋亡了(圖2F)。

圖2 TERT+TK-D細(xì)胞的特性 A：TERT+TK-D細(xì)胞與人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)一樣；B：TERT+TK-D細(xì)胞在紫外光照射下顯示綠色熒光；C：TERT+TK-D細(xì)胞在25 g·L-1 更昔洛韋作用下6 d內(nèi)全部凋亡；D：TERT+TK-D細(xì)胞表達(dá)TK基因、LTR序列，而正常人皮膚成纖維細(xì)胞不表達(dá)；E：TERT+TK-D細(xì)胞生長曲線；F：更昔洛韋藥物毒性實驗顯示，TERT+TK-D細(xì)胞最小更昔洛韋致死劑量為25 g·L-1

2.3 細(xì)胞CFE和特征實驗分為3組:20×103個·cm-23T3組(經(jīng)典密度)、5×103個·cm-23T3組和5×103個·cm-2TERT+TK-D細(xì)胞組。共培養(yǎng)10～13 d，所有組均形成了典型的角膜緣干細(xì)胞克隆,TERT+TK-D組CFE為(11.77±0.21)%，與同密度3T3組CFE (5.7%±0.89%)相比形成更多典型克隆(P<0.001)，與經(jīng)典密度3T3組相比，CFE差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.332)。TERT+TK-D細(xì)胞組(直徑>2 mm; CFE為3.37%±0.35%)比同密度3T3組(直徑>2 mm，CFE為1.30%±0.26%)和經(jīng)典密度3T3細(xì)胞組(直徑>2 mm， CFE為 2.07%±0.06%)有更多面積大、細(xì)胞數(shù)多的克隆形成(P=0.01、0.03)。免疫熒光染色結(jié)果顯示：TERT+TK-D組和3T3組細(xì)胞均表達(dá)K3 和ΔNp63(圖3A、B)，然而TERT+TK-D組K3陽性表達(dá)低于3T3組。Real-time PCR結(jié)果證實了免疫熒光染色的結(jié)果：3T3組K3表達(dá)高于TERT+TK-D組(P=0.001)，而兩組ΔNp63表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.982)。

圖3 角膜緣干細(xì)胞克隆特征 A：TERT+TK-D組與3T3組相比，共培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞較低表達(dá)角膜上皮分化標(biāo)記物K3；B：兩組表達(dá)角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記物ΔNp63無顯著差異

2.4 PCR檢測飼細(xì)胞殘留實驗按之前所述方法將更昔洛韋添加組和更昔洛韋未添加組培養(yǎng)獲得的細(xì)胞片的組織和細(xì)胞DNA提取，用PCR檢測細(xì)胞片中慢病毒特異LTR序列的表達(dá)。兩組細(xì)胞片均表達(dá)內(nèi)參GAPDH基因，但是LTR序列只表達(dá)于更昔洛韋未添加組。在更昔洛韋添加組，LTR序列不表達(dá)(圖4)。

圖4 PCR方法檢測角膜上皮再生細(xì)胞片中慢病毒特異LTR序列 GAPDH基因為陽性參照。LTR特異序列在更昔洛韋未添加組顯示陽性，而在更昔洛韋添加組未檢測到

2.5 培養(yǎng)的角膜緣上皮再生細(xì)胞片的特性角膜緣干細(xì)胞與TERT+TK-D或3T3細(xì)胞共培養(yǎng)形成角膜上皮再生細(xì)胞片，這些細(xì)胞在KCM培養(yǎng)12 d后，在添加25 g·L-1更昔洛韋 的KCM中降低液平面培養(yǎng)6～8 d促進(jìn)上皮復(fù)層化。經(jīng)過2～3周共培養(yǎng)，兩組都形成了4～5層復(fù)層上皮細(xì)胞片(圖5)。25 g·L-1更昔洛韋對于角膜緣上皮細(xì)胞和3T3飼細(xì)胞沒有毒副作用，而TERT+TK-D飼細(xì)胞在添加25 g·L-1更昔洛韋 的KCM中6 d后全部凋亡。細(xì)胞片切片免疫熒光染色顯示，兩組細(xì)胞片均表達(dá)角膜上皮細(xì)胞分化標(biāo)記K3、角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記物ΔNp63以及角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物K12(圖5)。與3T3組相比，TERT+TK-D組形成的細(xì)胞片較低表達(dá)K3，而在基底和翼細(xì)胞層較高表達(dá)ΔNp63；K12表達(dá)兩組無明顯差異。

圖5 角膜上皮再生細(xì)胞片的特征 A：經(jīng)過2～3周的共培養(yǎng)，TERT+TK-D組和3T3組均形成了4～5層復(fù)層角膜上皮細(xì)胞片；B：與3T3組相比，TERT+TK-D組角膜上皮細(xì)胞片較低表達(dá)角膜上皮分化標(biāo)記物K3；C：基底細(xì)胞和翼細(xì)胞中高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物ΔNp63；D：角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物K12表達(dá)在兩組無明顯差異

3 討論

本研究結(jié)果證實，轉(zhuǎn)基因、永生化、熒光標(biāo)記的可去除型人表皮成纖維細(xì)胞具有維持角膜緣干細(xì)胞生長、分化的能力，同時還可以防止飼細(xì)胞污染形成的再生細(xì)胞片。為了避免使用動物來源的飼細(xì)胞，人源性飼細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[13-14]、角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞[15-16]和皮膚成纖維細(xì)胞[17]，被廣泛用于替代3T3成纖維細(xì)胞應(yīng)用于臨床。Oie等[7]研究發(fā)現(xiàn)，人表皮成纖維細(xì)胞在口腔黏膜上皮細(xì)胞表面重建中取得良好效果；Sharma等[8]比較了人皮膚成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和3T3細(xì)胞在體外分別與人角膜緣干細(xì)胞和口腔黏膜細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人皮膚成纖維細(xì)胞優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，與3T3細(xì)胞可以媲美。我們的實驗也證實，人皮膚成纖維細(xì)胞與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞許多細(xì)胞因子表達(dá)相似，都表達(dá)HGF[18]、KGF[18]、 EPR[19]、 BDNF[20]、 bFGF[21]和N-cad[22]。我們的預(yù)實驗也顯示，角膜緣干細(xì)胞與人皮膚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組的CFE高于與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組的CFE。因此，人皮膚成纖維細(xì)胞有著替代3T3細(xì)胞用于臨床的廣泛前景。

我們將hTERT基因[23]轉(zhuǎn)導(dǎo)入人皮膚成纖維細(xì)胞以防止細(xì)胞多次分裂后衰老。目前研究表明，永生化人皮膚成纖維細(xì)胞在體外連續(xù)傳代超過6個月，大于50代，仍保持旺盛的分裂能力，熒光可視，并且對更昔洛韋藥物敏感。賦予細(xì)胞永生化后，可以大大簡化細(xì)胞的保存與使用流程，降低了原代培養(yǎng)成本，減少了重復(fù)使用慢病毒的風(fēng)險。TK基因也導(dǎo)入hTERT和EGFP轉(zhuǎn)染的真皮成纖維細(xì)胞[24]，以防止未知的感染和異種飼細(xì)胞污染。我們通過PCR檢測LTR序列的實驗發(fā)現(xiàn)，更昔洛韋處理的與TERT+TK-D飼細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞片沒有受到飼細(xì)胞污染，而沒有經(jīng)過更昔洛韋處理的同樣條件培養(yǎng)的細(xì)胞片卻檢測到殘留的TERT+TK-D飼細(xì)胞LTR序列基因?？扇コ惋暭?xì)胞可以靈活、方便地應(yīng)用于各種需要飼細(xì)胞接觸培養(yǎng)或者混合培養(yǎng)的情況。此外，飼養(yǎng)細(xì)胞可去除的特性也降低了轉(zhuǎn)染外源基因產(chǎn)生的未知風(fēng)險，增加使用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的安全性。

Sharma等[8]比較了人皮膚成纖維細(xì)胞與3T3細(xì)胞對角膜緣干細(xì)胞增殖的作用，發(fā)現(xiàn)CFE和角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)兩組細(xì)胞作用相似，實驗證實TERT、EGFP、TK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞保持了纖維細(xì)胞形態(tài)和旺盛的分裂增殖力，與正常人皮膚成纖維細(xì)胞一樣具有支持角膜緣干細(xì)胞生長的特性。本研究中TERT+TK-D組和3T3組均形成了4～5層復(fù)層上皮角膜上皮再生細(xì)胞片。角膜緣干細(xì)胞的CFE在TERT+TK-D組和經(jīng)典密度3T3組沒有顯著差異。值得注意的是，TERT+TK-D組形成了更多面積大(直徑>2 mm)的克隆，并且比同密度3T3組的CFE高。此外，免疫組織化學(xué)染色和Real-Time PCR結(jié)果顯示，TERT+TK-D組與3T3組相比低表達(dá)角膜上皮分化標(biāo)記K3，并且更好地維持了角膜上皮層細(xì)胞的未分化狀態(tài)。

Bullock等[25]用人皮膚成纖維細(xì)胞成功培養(yǎng)出無動物源性成分人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞。Rodriguez-Piza等[26]在無動物源性成分培養(yǎng)體系下成功分離出原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示這些細(xì)胞既能誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞，又能作為飼細(xì)胞支持多能干細(xì)胞的生長。在目前的研究中，我們主要關(guān)注創(chuàng)建TERT+TK-D細(xì)胞，研究創(chuàng)建的細(xì)胞生物學(xué)特性和飼細(xì)胞作用，結(jié)果顯示，創(chuàng)建的人皮膚成纖維飼細(xì)胞保持了原細(xì)胞的生物學(xué)特性，具有支持角膜緣干細(xì)胞生長的能力，同時變得使用更方便、經(jīng)濟(jì)和安全。進(jìn)一步的研究將在無動物源性成分培養(yǎng)體系下，用人源性成分取代目前常用的動物源性成分，如用人血清替代胎牛血清[27]等。同時，將創(chuàng)建的人皮膚成纖維飼細(xì)胞廣泛應(yīng)用于其他再生醫(yī)療研究，比如與口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)等。

綜上所述，通過轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)建了永生化可去除型人皮膚成纖維飼細(xì)胞，并且證實了該細(xì)胞安全有效。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因人皮膚成纖維飼細(xì)胞在角膜再生醫(yī)療方面將有著廣闊的應(yīng)用前景。