張楚 朱子誠 應(yīng)充慧 展欣 劉夏薇

葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障是嚴(yán)重的眼科疾病，可引起視力障礙甚至致盲[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，葡萄膜炎患者的前囊膜晶狀體上皮細(xì)胞靠近前房，容易受到眼內(nèi)炎癥因子影響。晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體纖維與房水間的調(diào)解屏障，起到調(diào)節(jié)離子濃度和水分積聚的作用，因而其結(jié)構(gòu)功能變化被認(rèn)為是白內(nèi)障發(fā)展的細(xì)胞基礎(chǔ)[2]。由此推測，葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞可能存在結(jié)構(gòu)改變。

NLRP3炎癥小體是由Caspase-1前體與NLRP3通過接頭蛋白ASC組成。Caspase-1前體自身活化后，促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18釋放，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體參與一些眼科疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性白內(nèi)障、葡萄膜炎等的發(fā)病過程[3-5]。本研究探討葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以及前囊膜超微結(jié)構(gòu)變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象以及分組隨機(jī)選取2018年8月至2019年6月我院眼科住院部收治的葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者17例(22眼)作為試驗(yàn)組，老年性白內(nèi)障患者10例(18眼)作為對照組。均于白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)中環(huán)形撕囊獲取前囊膜。納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù) 2016 年中華醫(yī)學(xué)會制定的《葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者的診斷與治療標(biāo)準(zhǔn)》。排除葡萄膜炎繼發(fā)青光眼、葡萄膜炎合并糖尿病、葡萄膜炎合并高度近視的患者；排除受糖尿病、器官損傷以及高血壓影響或受年齡、工作性質(zhì)、生活環(huán)境、病情嚴(yán)重程度、性別以及生活習(xí)慣等因素影響的患者。上述病例均無長期眼科用藥史。在手術(shù)前所有葡萄膜炎患眼炎癥反應(yīng)安靜期均大于3個(gè)月。本研究方案獲得安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器兔抗人Caspase-1抗體(巴傲得生物科技有限公司)，兔抗人NLRP3抗體、兔抗人ASC抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，免疫組織化學(xué)二抗通用型PV 6000、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)，生物組織包埋機(jī)(湖北亞光公司)，徠卡切片機(jī)(德國Leica公司)，JEM1400型透射電子顯微鏡(上海鑄金分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測將晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞組織取下后立即用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，把包埋好的標(biāo)本置于液氮預(yù)冷2 min，隨后置于-80 ℃低溫冰箱保存。將石蠟切片用二甲苯脫蠟后置于酒精和蒸餾水中浸泡水化，PBS液浸泡；抗原高壓修復(fù)。切片浸入水中，倒入EDTA修復(fù)液后煮沸，隨后修復(fù)約2 min后停止。冷卻后滴加30 g·L-1H2O2，室溫孵育20 min，PBS沖洗3遍,將切片甩干，加一抗，37 ℃孵育60 min，PBS沖3遍，甩干后加二抗孵育30 min，PBS沖3遍，DAB顯色。并運(yùn)用圖像分析軟件(Image ProPlusV6．0)對NLRP3、Caspase-1和接頭蛋白ASC蛋白的表達(dá)進(jìn)行光密度分析。

1.2.2 前囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察將前囊膜放入戊二醛后于5 ℃冰箱保存24 h。使用PBS緩沖液漂洗后固定在10 g·L-1四氧化鋨中，固定后再次漂洗，乙醇脫水、固定后包埋，取出包埋塊修整后超薄切片，片厚70 nm，銅網(wǎng)撈片，鉛、鈾電子染色，于透射電鏡下觀察并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，本研究測量指標(biāo)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。試驗(yàn)組和對照組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者晶狀體前囊膜中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測顯示，兩組患者晶狀體前囊膜中均有NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)；試驗(yàn)組晶狀體前囊膜中NLRP3、Caspase-1及接頭蛋白ASC表達(dá)水平均明顯高于對照組(均為P<0.05)。見圖1至圖3和表1。

圖1 NLRP3在晶狀體前囊膜中的表達(dá) A：對照組；B：試驗(yàn)組。放大倍數(shù)：×200

圖2 Caspase-1在晶狀體前囊膜中的表達(dá) A：對照組；B：試驗(yàn)組。放大倍數(shù)：×200

圖3 接頭蛋白ASC在晶狀體前囊膜中的表達(dá) A：對照組；B：試驗(yàn)組。放大倍數(shù)：×200

表1 兩組患者晶狀體前囊膜中NLRP3、Caspase-1、接頭蛋白ASC表達(dá)的光密度值

2.2 兩組患者前囊膜的超微結(jié)構(gòu)情況試驗(yàn)組患者前囊膜的晶狀體上皮細(xì)胞可見明顯的細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃縮邊集，細(xì)胞核膜皺褶、輕度增寬，線粒體形態(tài)基本正常、部分線粒體嵴突消失，細(xì)胞質(zhì)中可見典型的凋亡小體。對照組有輕度凋亡改變。見圖4。

圖4 電子顯微鏡下晶狀體前囊膜超微結(jié)構(gòu) A：試驗(yàn)組患者前囊膜晶狀體上皮細(xì)胞可見細(xì)胞凋亡改變，有典型的凋亡小體(箭頭所示)；B： 對照組患者前囊膜晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)多數(shù)正常，有輕度凋亡改變

3 討論

已有研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞異常是白內(nèi)障進(jìn)展的基礎(chǔ)，使用H2O2產(chǎn)生氧化應(yīng)激會促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致白內(nèi)障形成[6]。晶狀體上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激可以促使NLRP3介導(dǎo)的IL-1β激活，說明NLRP3炎癥小體可能與白內(nèi)障的進(jìn)展存在一定關(guān)系[7-8]。本研究結(jié)果顯示，兩組患者晶狀體前囊膜中均有NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明NLRP3炎癥小體亦可能參與老年性白內(nèi)障的發(fā)展。

目前，人們對葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制仍不明確，普遍猜測其最常見原因?yàn)樽陨砻庖叻磻?yīng)。已經(jīng)證實(shí)葡萄膜炎發(fā)病與多種細(xì)胞因子有關(guān)，包括IL-1、IL-6 、IL-8、IL-23等。其中IL-1β最常見和最主要的來源是NLRP3炎癥小體。研究證實(shí)，NLRP3炎癥小體與葡萄膜炎的發(fā)生有關(guān)[9]。IL-1β可以促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生，葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者的房水及血清中血管內(nèi)皮生長因子的含量增多[10]。使用IL-1β調(diào)節(jié)抗體XOMA052可以有效治療急性加重耐藥型Behcet葡萄膜炎[11]，IL-18與Behcet病的發(fā)生及疾病活動(dòng)有關(guān)。在HLA-B27相關(guān)性葡萄膜炎患者的房水中，IL-18含量增高，且其與房水閃輝有關(guān)[12-13]。葡萄膜炎通過引起晶狀體上皮細(xì)胞病理改變，促進(jìn)并發(fā)性白內(nèi)障的進(jìn)一步發(fā)展。但NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白在葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者的晶狀體上皮細(xì)胞是否表達(dá)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組晶狀體上皮細(xì)胞有NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)。說明NLRP3炎癥小體與葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病可能存在一定關(guān)系。

電鏡觀察可以了解細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變，以往的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制之一[14-15]，但關(guān)于葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞電鏡觀察研究較少。本研究結(jié)果顯示，電鏡下，試驗(yàn)組有明顯的細(xì)胞凋亡變化，說明細(xì)胞凋亡是葡萄膜炎并發(fā)白內(nèi)障患者前囊膜中重要的病理改變。在細(xì)胞凋亡改變明顯的試驗(yàn)組，NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)亦較高，表明細(xì)胞凋亡與NLRP3炎癥小體可能存在一定的相關(guān)性。

細(xì)胞焦亡是一種快速的炎癥反應(yīng)性的細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為早期細(xì)胞膜孔隙形成、細(xì)胞滲透性膨脹[16]。由于NLRP3在細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡中都起到重要作用[17]，且細(xì)胞焦亡也可能是白內(nèi)障發(fā)病的機(jī)制之一[18]，因此NLRP3炎癥小體通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡這兩種途徑來參與白內(nèi)障的進(jìn)展。以上研究顯示，在NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白明顯表達(dá)的試驗(yàn)組，存在細(xì)胞焦亡改變。