劉鵬 岑妍慧 林江 蘭太進(jìn)

白內(nèi)障，尤其是老年性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)，是全球最常見的眼病之一，已成為第三世界國家中第一位致盲眼病[1]。白內(nèi)障是一種因眼球晶狀體病變而導(dǎo)致晶狀體混濁的疾病，被認(rèn)為是一種構(gòu)象疾病。晶狀體是人體內(nèi)蛋白質(zhì)含量最高的組織，當(dāng)其α-晶狀體蛋白發(fā)生氧化損傷時(shí)，會導(dǎo)致晶狀體蛋白折疊錯(cuò)誤增加，加劇蛋白變性，聚集成散射光的聚集體，晶狀體就會混濁，這可能是白內(nèi)障發(fā)生的重要原因[2-3]?？偟膩碚f，白內(nèi)障是一種多因素誘發(fā)疾病，與衰老、紫外線輻射、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、糖尿病、吸煙、酒精等有關(guān)[4]。盡管每種白內(nèi)障的確切病因仍然不清楚，但對許多動(dòng)物模型和人類的研究表明，白內(nèi)障的形成與晶狀體上皮細(xì)胞的應(yīng)激損傷和凋亡有關(guān)[5]。抑制晶狀體上皮細(xì)胞的應(yīng)激損傷和凋亡能有效防治白內(nèi)障[6-7]。合浦珍珠產(chǎn)于廣西北海合浦，為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。除了作為名貴、高雅的裝飾品，合浦珍珠還是著名的道地藥材，在我國已有2000多年的藥用歷史[8]。現(xiàn)代典籍《中華人民共和國藥典》及《中藥大辭典》均記載：“珍珠具有安神定驚、明目去翳、解毒生肌”的功能。合浦珍珠主要活性物質(zhì)包含微量元素、類胡蘿卜素、維生素B、蛋白質(zhì)、小分子多肽、多糖、人體所需的8種必需氨基酸，以及具有特殊活性作用的非蛋白氨基酸，如?；撬岬龋渚哂泻芎玫目寡趸钚?，自古以來就常出現(xiàn)在各種方劑中[9-10]。本課題組前期已采用果蔬、蜂蜜的有機(jī)酸、活性酶低溫水解合浦珍珠，制得合浦珍珠水解液，能完整保留珍珠原質(zhì)中的肽等天然活性物質(zhì)，可用作藥品、營養(yǎng)保健品等的原料[11-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過體外制備過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)氧化損傷模型，探討南珠水解液對氧化損傷的HLEC是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器HLEC細(xì)胞株HLEB3(北京北納聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)研究院)，南珠水解液凍干粉(廣西北海市寶珠林海洋科技有限公司)；H2O2(美國Sigma公司)；完全DMEM培養(yǎng)基、CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(MULTI SCIENCES聯(lián)科生物公司)；SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。酶標(biāo)分析儀(美國Biotek公司)；透射電鏡(日本JEOL公司)；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 HLEC的細(xì)胞增殖檢測HLEB3細(xì)胞培養(yǎng)至70%時(shí)消化計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng)，每孔加入100×103個(gè)細(xì)胞，加入不同濃度(0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1)南珠水解液，培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后，每孔加10 μL CCK8檢測試劑，在37 ℃孵育，酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測培養(yǎng)24 h和48 h每孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，并據(jù)此選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)中南珠水解液濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組，不額外加藥；氧化損傷組，加入H2O2至終濃度為300 μmol·L-1；南珠水解液處理組，加入H2O2至終濃度為300 μmol·L-1，加入南珠水解液至終濃度200 mg·L-1，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況收集1×106～3×106個(gè)HLEB3細(xì)胞，加1 mL PBS 1500 r·min-1離心3 min，洗滌2遍。取300 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI-PE。輕輕吹打混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 電鏡下觀察3組細(xì)胞收集3組細(xì)胞。體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定各組細(xì)胞24 h，控制溫度為4 ℃，10 g·L-1鋨酸后固定，0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗。乙醇-丙酮梯度脫水，丙酮-環(huán)氧樹脂梯度包埋，超薄切片機(jī)切片70 nm，30 g·L-1醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，電鏡下觀察并拍照。

1.2.4 3組細(xì)胞生化檢測收集3組細(xì)胞，破碎細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測總蛋白濃度，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行樣品處理，然后使用酶標(biāo)儀在對應(yīng)波長處檢測每孔的A值，檢測各組HLEB3細(xì)胞內(nèi)谷光甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。

2 結(jié)果

2.1 南珠水解液對HLEB3細(xì)胞生長的作用在HLEB3細(xì)胞培養(yǎng)液中加入南珠水解液，分為4組，濃度分別為0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1。在培養(yǎng)24 h和48 h后檢測細(xì)胞增殖水平，結(jié)果顯示：培養(yǎng)24 h后各組細(xì)胞增殖水平無明顯差異；48 h后50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1南珠水解液組與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。南珠水解液對HLEB3增殖作用具有一定的劑量依賴效應(yīng)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇200 mg·L-1南珠水解液為最佳處理濃度。見表1。

表1 不同濃度南珠水解液處理后HLEB3細(xì)胞增殖水平

2.2 南珠水解液對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的HLEB3細(xì)胞凋亡作用通過流式細(xì)胞儀檢測正常對照組、氧化損傷組和南珠水解液處理組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示氧化損傷組細(xì)胞凋亡率最高，其次是南珠水解液處理組和正常對照組。見表2和圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況 A：正常對照組；B：氧化損傷組；C：南珠水解液處理組

表2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡總體情況及早、晚期凋亡情況

2.3 電鏡觀察各組HLEB3細(xì)胞電鏡下正常對照組HLEB3細(xì)胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較多，細(xì)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較致密，核糖體密布；氧化損傷組HLEB3細(xì)胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較少而且有不少斷裂了，有些細(xì)胞胞核皺縮，細(xì)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較疏松，核糖體分散，可見凋亡小體和空泡；南珠水解液處理組HLEB3細(xì)胞相對于氧化損傷組細(xì)胞質(zhì)中凋亡小體和空泡較少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也更正常。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果 A：正常對照組；B：氧化損傷組；C：南珠水解液處理組

2.4 南珠水解液對HLEB3細(xì)胞抵抗氧化損傷的作用各組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的酶活性以及MDA含量檢測結(jié)果顯示，氧化損傷組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的酶活性低于正常對照組，南珠水解液處理組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的酶活性高于氧化損傷組，且GSH-Px的酶活性高于正常對照組；MDA含量則是氧化損傷組最高，其次是南珠水解液處理組和正常對照組。見表3。

表3 各組HLEB3細(xì)胞中GSH-PX和SOD酶活性及MDA含量比較

3 討論

隨著我國人口老齡化的日趨嚴(yán)重，ARC發(fā)病率逐年上升，已成為我國第一位致盲眼病，嚴(yán)重影響老年人的健康[14]。在發(fā)達(dá)國家，大多數(shù)白內(nèi)障可以通過手術(shù)治療，而在資源匱乏的發(fā)展中國家，許多受白內(nèi)障影響的患者無法享受到最先進(jìn)的治療[15]。所以開發(fā)成本較低的方法來預(yù)防或延遲ARC的形成，并探討它們的防治機(jī)制具有重要意義。

在生理狀態(tài)下，HLEC是眼球晶狀體新陳代謝最活躍部分，其不斷分化為晶狀體纖維細(xì)胞，承擔(dān)著晶狀體生長、分化及損傷修復(fù)作用，對晶狀體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、水平衡及透明性等方面起到重要作用[5-16]。一旦晶狀體上皮細(xì)胞出現(xiàn)病理突變，將會引起晶狀體混濁，導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生[17]。HLEC凋亡是除先天性白內(nèi)障外各種白內(nèi)障發(fā)生的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[5]。目前公認(rèn)的白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制有氧化損傷學(xué)說和細(xì)胞凋亡學(xué)說。活性氧(reactive oxygen，ROS)如H2O2引起的氧化應(yīng)激，是HLEC凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是白內(nèi)障發(fā)生的主要原因[18-19]。因此，預(yù)防H2O2誘導(dǎo)的HLEC氧化應(yīng)激和凋亡可能是延緩白內(nèi)障發(fā)展的重要治療策略。

珍珠富含多種活性物質(zhì)，包含微量元素、類胡蘿卜素、維生素B、蛋白質(zhì)、小分子多肽、多糖、多種氨基酸，常作為主要成分用于防治白內(nèi)障[20-21]，本課題組前期已制備好南珠水解液，且本課題組岑妍慧等[22]發(fā)現(xiàn)南珠水解液能促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)其分泌NO和抑制活性氧分泌，在保護(hù)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞方面發(fā)揮了有效作用。

本研究通過H2O2誘導(dǎo)構(gòu)建HLEC氧化損傷模型，通過不同濃度的南珠水解液以及不同處理時(shí)間觀察對HLEB3細(xì)胞生長影響，24 h后各組之間無顯著差異，說明處理液對細(xì)胞無毒害作用；48 h后50 mg·L-1南珠水解液組細(xì)胞增殖水平高于空白對照組，而100 mg·L-1南珠水解液組細(xì)胞增殖水平高于50 mg·L-1組，100 mg·L-1南珠水解液組細(xì)胞增殖水平和200 mg·L-1南珠水解液組差異不顯著，說明在48 h時(shí)，200 mg·L-1南珠水解液組能夠促進(jìn)HLEB3生長。而為了更好地說明南珠水解液的作用，我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度200 mg·L-1南珠水解液處理細(xì)胞。

本研究通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)氧化損傷組細(xì)胞凋亡率最高，南珠水解液處理組細(xì)胞凋亡率高于正常對照組、低于氧化損傷組。通過定量分析可見南珠水解液可以抑制由H2O2誘導(dǎo)的HLEB3細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡，且對晚期凋亡抑制作用更顯著，為南珠水解液防治白內(nèi)障提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

透射電鏡可以直接觀察到細(xì)胞超微形態(tài)變化，本研究觀察到正常對照組HLEB3細(xì)胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較多，細(xì)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較致密，核糖體密布；氧化損傷組 HLEB3細(xì)胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較少，而且有不少斷裂了，有些細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較疏松，核糖體分散，可見凋亡小體和空泡；南珠水解液處理組HLE-B3細(xì)胞相對于氧化損傷組，細(xì)胞質(zhì)中凋亡小體和空泡較少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也更正常。表明南珠水解液對HLEB3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

眾所周知，氧化應(yīng)激的發(fā)生是由于抗氧化防御系統(tǒng)與細(xì)胞內(nèi)氧化作用失衡所致[23]。眼晶狀體內(nèi)有一系列抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)其避免氧化損傷。該抗氧化系統(tǒng)由非酶性抗氧化物和酶性抗氧化物組成。非酶性的抗氧化物如谷胱甘肽、類胡蘿卜素、維生素C、維生素E、牛磺酸和某些微量元素等，酶性抗氧化物如SOD、GSH-Px等[24]。其中SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，能有效清除脂質(zhì)過氧化過程產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，降低其毒性作用，避免對細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷，從而保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常[25]。GSH-Px是體內(nèi)一種重要的含硒抗氧化酶，能特異性催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)對H2O2的還原反應(yīng)，能有效清除H2O2，從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[26]。另外，細(xì)胞會產(chǎn)生一些氧化產(chǎn)物，如MDA，為自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，MDA的含量水平可反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度，常作為判斷脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)[27]。然而，當(dāng)HLEC氧自由基產(chǎn)生過多和(或)抗氧化能力降低，會誘發(fā)晶狀體蛋白氧化損傷變性，引起晶狀體混濁，最終誘發(fā)白內(nèi)障[28]。在本研究中，各組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的酶活以及MDA含量生化檢測結(jié)果顯示，氧化損傷組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的酶活性顯著低于正常對照組，南珠水解液處理組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的酶活性顯著高于氧化損傷組，且GSH-Px的酶活性顯著高于正常對照組；MDA含量則是氧化損傷組顯著高于南珠水解液處理組和正常對照組。表明南珠水解液通過升高SOD、GSH-Px活性，降低細(xì)胞MDA含量來保護(hù)HLEB3細(xì)胞，能有效防止H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。

總之，本研究結(jié)果證實(shí)南珠水解液具有抗氧化損傷及抗凋亡作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)、降低活性氧含量有關(guān)，但南珠水解液其具體作用機(jī)制，通過什么信號通路發(fā)揮保護(hù)作用，還有待后續(xù)進(jìn)一步探討，從而為南珠水解液防治ARC提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。