李祎璠 趙珍陽 杜 康 孫傳強 龔子珊 張 勇 王世功 汪 曣*

(1．天津大學(xué) 精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.山東東儀光電儀器有限公司，煙臺 264000)

1 引言

蛋白質(zhì)定量在生物學(xué)研究中具有重要意義，蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化控制著生物細(xì)胞或生物體中的許多特殊功能[1]。目前，基于抗體的免疫分析是特異性蛋白定量的主要手段。1959年，放射免疫分析法(RIA)由Yallow等[2]建立，通過放射性同位素標(biāo)記抗體，但該方法存在放射性健康危害、廢物處理等問題。之后提出的一些非放射性免疫分析方法，在過去幾十年中已成功地應(yīng)用在分子檢測上，包括酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)[3]、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)[4]、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)[5]、和電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)[6]等，但這些方法在動態(tài)范圍、靈敏度、分辨率等問題上仍受到明顯的限制[7]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)作為測定多種金屬和幾種非金屬最主要也最靈敏的商業(yè)化儀器[8]，其優(yōu)點包括檢測限低、基質(zhì)效應(yīng)低、動態(tài)范圍寬等[9]。因此，基于ICP-MS的免疫分析法[10]自2001年首次提出以來，已成為免疫檢測領(lǐng)域一個快速發(fā)展的研究方向。該方法的優(yōu)點包括：(1)易于通過信號放大手段進(jìn)一步提高檢測靈敏度；(2)ICP-MS是對標(biāo)簽上的原子直接進(jìn)行檢測，因此檢測與標(biāo)記物的光學(xué)、電學(xué)、磁性等性質(zhì)無關(guān)；(3)ICP-MS在元素的檢測上的良好分辨率使其擁有了實現(xiàn)多組分同時檢測的可能。

目前已經(jīng)實現(xiàn)了小分子、蛋白質(zhì)、核酸以及單細(xì)胞等生物樣品的檢測[11]。本文綜述了ICP-MS免疫分析的主要發(fā)展和應(yīng)用，以各項技術(shù)的發(fā)展順序為線索，著重介紹其中的信號放大策略，并討論不同技術(shù)的優(yōu)點和局限性。

2 ICP-MS免疫分析方法的信號放大策略

2.1 基于ICP-MS的免疫分析方法簡介

1980年，Houk等[12]首次采用將電感耦合等離子體作為離子源與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，三年后誕生了第一臺商用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)。如圖1所示，ICP-MS通常由進(jìn)樣系統(tǒng)、ICP源和質(zhì)量檢測器組成。樣品(通常為液體)被泵入進(jìn)樣系統(tǒng)，形成氣溶膠，之后通過ICP炬管，在等離子體的不同加熱區(qū)被干燥、蒸發(fā)、霧化和電離。在此過程中高效的離子產(chǎn)生、提取和傳輸賦予了ICP-MS特有的超快檢測能力。典型的ICP-MS(配備四極桿質(zhì)量分析器)可以以高靈敏度同時檢測100多種同位素，分辨率在0.7～1.0個原子單位。

圖1 典型的ICP-MS系統(tǒng)示意圖[13]

為了獲得免疫分析的特異性，標(biāo)記試劑通常需要費力的設(shè)計與合成，極大限制了其可用性，不僅價格高昂，而且難以維持穩(wěn)定性。并且，只有對大量的生物標(biāo)志物的綜合調(diào)查才能提供準(zhǔn)確的臨床診斷，因此迫切需要高靈敏度和同時多組分免疫分析的研究。

2.2 元素標(biāo)記結(jié)合ICP-MS免疫分析

抗體能被ICP-MS有效檢測的前提是在其上進(jìn)行元素標(biāo)記[14]。2001年，Zhang等開創(chuàng)性地報道了基于ICP-MS和元素標(biāo)記免疫分析聯(lián)用的方法，定量檢測抗促甲狀腺激素(TSH)[15]和總甲狀腺素(T4)[16](如圖2)。使用常用于TRFIA中的元素標(biāo)簽，通過ICP-MS檢測，得到了與RIA和CLIA方法具有良好一致性的定量結(jié)果，證明了該方法在競爭和夾心免疫體系中的有效性。

圖2 非均相免疫分析的兩種形式

與固相載體(如微孔板)相比，將磁納米顆粒作為反應(yīng)載體能夠進(jìn)一步的提高檢測靈敏度。免疫磁球由于其較大的比表面積、較快的反應(yīng)動力學(xué)等特點，適用于快速、靈敏的免疫反應(yīng)[17]。Peng等[18]提出了基于汞離子標(biāo)記磁性免疫分析的ICP-MS檢測方法，檢測人血清癌胚抗原(CEA)，并使用體積排阻色譜(SEC)分離標(biāo)記汞離子的抗體和過量汞標(biāo)記，結(jié)果與CLIA具有一致性。

在ICP-MS細(xì)胞分析領(lǐng)域，質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)具有重要意義。2009年，Bandura等開發(fā)了質(zhì)譜流式細(xì)胞儀ICP-TOF-MS(CyTOFFM，DVS公司)，通過不同稀土元素標(biāo)記的抗體對白血病細(xì)胞株和白血病人單細(xì)胞表面20種抗原實現(xiàn)了同時檢測。

在數(shù)據(jù)處理和誤差補償方面，研究者們也做了大量工作。2018年，Zhang等[17]使用Sm和Y元素標(biāo)記建立了一種基于ICP-MS的競爭免疫分析比值定量法，使用Y標(biāo)簽修飾抗體作為內(nèi)標(biāo)，Sm結(jié)合抗原與待測β2-微球蛋白抗原競爭性結(jié)合，取兩種元素的比值作為量化信號，補償了操作過程中的粒子損失，提高了定量結(jié)果的精度，檢出限為0.17 μg/mL。

早期用于ICP-MS免疫分析方法的元素離子標(biāo)記物主要來自傳統(tǒng)的免疫測定方法，如表1所示，標(biāo)記元素應(yīng)對ICP-MS有高靈敏度，并具有低的同質(zhì)異位素干擾[19]。然而，大環(huán)化合物的高空間位阻、汞化合物的高毒性等問題，需要通過研究針對ICP-MS免疫方法設(shè)計的特殊標(biāo)簽來解決。

表1 元素標(biāo)記結(jié)合ICP-MS免疫分析的應(yīng)用

2.3 納米顆粒標(biāo)記結(jié)合ICP-MS免疫分析

使用納米粒子標(biāo)記放大檢測信號引起了許多學(xué)者的興趣，其優(yōu)點在于：每個納米顆粒6標(biāo)簽中包含大量可檢測原子(以金納米顆粒為例，10nm直徑的AuNPs中含有約30000個Au原子)，易于進(jìn)一步提高抗體檢測的靈敏度。2002年，Zhang等[27]建立了膠體金納米顆粒標(biāo)記抗體應(yīng)用與夾心免疫反應(yīng)的方法，使用標(biāo)記過的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)測定兔抗人IgG，檢出限為0.4ng/mL。

同年，Quinn等[28, 29]使用金納米團(tuán)簇和Eu作為標(biāo)記，每個1.4nm的金團(tuán)簇包含大約70個金原子，將離心過濾、體積排阻凝膠過濾、蛋白質(zhì)瓊脂糖A親和色譜和酶聯(lián)免疫吸附分析四種方法與ICP-MS連用，實現(xiàn)了復(fù)雜生物基質(zhì)中兩種蛋白質(zhì)的同時檢測。作者指出，使用金納米顆粒的潛在缺點是金對典型的ICP-MS樣品引入系統(tǒng)具有較高的表面親和力，然而實驗觀察到在樣品中存在蛋白質(zhì)時這種效應(yīng)顯著降低，可能是由于表面的絡(luò)合或鈍化作用。

將納米顆粒標(biāo)記與其他方法聯(lián)用可以在信號放大的同時獲得更好的信號穩(wěn)定性和靈敏度。如圖3所示，Ko等[30]使用金納米顆粒作為標(biāo)記物，使用摻雜有Cs和FITC的多核磁性納米顆粒(MMNP)用于磁分離，特異性的提取血清中的CA19-9，并且將摻雜的Cs用作標(biāo)記顆粒的比率測量的內(nèi)標(biāo)。這種比率法補償了磁分離中的顆粒損失，并抑制了信號波動，顯著提高了校準(zhǔn)線性度。該方法檢測限為0.02 U/mL，比使用元素標(biāo)記的ICP-MS報道方法的檢測限低300倍以上，與ELISA相比提高約500倍。Liu等[31, 32]使用銀增強-金納米離子標(biāo)記的方法，檢測人癌胚抗原CEA，檢出限低至0.03ng/mL，經(jīng)過15分鐘的信號放大程序，將檢測靈敏度提高了60倍。

圖3 量子點標(biāo)記免疫反應(yīng)示意圖[30]

使用傳統(tǒng)ICP-MS積分模式檢測方法來分析納米粒子只能實現(xiàn)單分子檢測，不夠靈敏，而使用時間分辨模式(SP-ICP-MS)有望進(jìn)一步提高靈敏度。2009年，Zhang等[33, 34]首次證明了通過SP-ICP-MS可以實現(xiàn)單納米粒子標(biāo)記的免疫分析，并證明了該方法可以用于競爭和非競爭免疫分析(對AFP的檢出限達(dá)到了0.016ng/mL，對兔抗人IgG的檢出限達(dá)到了0.1ng/mL)。同時，討論了不同直徑金納米顆粒的信號特征，與傳統(tǒng)積分模式進(jìn)行對比，證明了該方法可以實現(xiàn)更高靈敏度的免疫分析。

另外，量子點也可以作為ICP-MS免疫分析的標(biāo)記物。Hu等報道了使用CdSe NPs[35]和PbS NPs[36]標(biāo)簽用于ICP-MS免疫分析。提出了用CdSe NPs標(biāo)簽和微同心霧化器(MCN)ICP-MS結(jié)合免疫親和整體毛細(xì)管微萃取(CME)測定人血清中IgG的方法，給出基于Cd信號的檢出限為0.058 ng/mL，基于Se信號的檢出限為0.097 ng/mL。另外，在PbS NPs標(biāo)記后，采用微流控芯片磁性免疫分析法法結(jié)合電熱蒸發(fā)(ETV) ICP-MS法測定CEA，方法檢出限為0.058 ng/mL。研究表明[37]，ICP-MS檢測方法能夠降低基質(zhì)效應(yīng)，并減輕量子點表面非特異性吸附影響(表2)。

表2 納米粒子標(biāo)記結(jié)合ICP-MS免疫分析的應(yīng)用

2.4 金屬聚合物結(jié)合ICP-MS免疫分析

金屬聚合物標(biāo)簽可以包含多個給定離子，ICP-MS信號隨著給定元素原子的數(shù)量線性增加，極大地提高了免疫分析的靈敏度，并且動態(tài)范圍廣、復(fù)雜基質(zhì)干擾小。2007年，Lou等[46]開發(fā)了一種帶有多種金屬螯合配體的水溶性聚合物作為標(biāo)記物，如圖4a所示，每條鏈帶有33個鑭系金屬離子，同時測定兩種細(xì)胞表面上的5種抗體，這些抗體的豐度相差超過兩個數(shù)量級。2010年，Majonis等[47]合成了用于抗體標(biāo)記的第二代金屬螯合聚合物，如圖4b所示，使用這種含有大量DTPA基團(tuán)和Mal的聚合物在小鼠抗人IgG上標(biāo)記了159Tb，ICP-MS檢測結(jié)果顯示每個抗體上含有161±4個159Tb，等溫滴定量熱法(ITC)結(jié)果顯示一個抗體上含有2.4±0.3個聚合物。將這種金屬螯合物用于11重單細(xì)胞分析，鑒定并豐富了人臍帶血中的不同細(xì)胞群。

圖4 圖名

2014年，Bruckner等[48]用DOTA標(biāo)記的氨基酸作為結(jié)構(gòu)單元，合成了多肽作為稀土元素探針。使用的固相多肽合成法(SPPS)是一種寡聚多肽的合成方法，其合成標(biāo)記物只有4個DOTA結(jié)構(gòu)單元。盡管探針數(shù)量相對較低，但SPPS方法能夠保證每個標(biāo)記物上可絡(luò)合確定數(shù)目的稀土離子，從而用于生物大分子的精準(zhǔn)定量(表3)。

表3 金屬聚合物標(biāo)記結(jié)合ICP-MS免疫分析的應(yīng)用

2.5 擴增技術(shù)結(jié)合ICP-MS免疫分析

傳統(tǒng)元素標(biāo)記方法結(jié)合DNA擴增技術(shù)能夠很好的提高ICP-MS的檢測靈敏度。最為普遍的放大反應(yīng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增反應(yīng)(RCA)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)等，都已有基于ICP-MS的分析方法報道[53]。

2014年，Brukner等[55]使用DNA連接酶擴增和磁性微球分離，利用Tb標(biāo)記DNA探針，對DNA的檢出限達(dá)到2.6 amol，與傳統(tǒng)無擴增DNA檢測法的靈敏度提高了6000倍。2018年，Zhang等[54]提出了基于禽流感病毒(AIV)表面上凝集素ConA和糖蛋白之間的選擇性識別和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)信號放大的ICP-MS病毒粒子分析方法，如圖5所示，以H9N2為模型，由于AuNPs和HCR的雙重擴增效應(yīng)，檢出限降至0.12 ng/mL，與ELISA方法相比，檢出限提高了兩個數(shù)量級，并且避免了耗時的病毒裂解和蛋白質(zhì)或核酸提取程序。2019年，Li等[56]報道了一種用于計數(shù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的方法，通過結(jié)合滾環(huán)擴增(RCA)和金納米顆粒(Au NPs)標(biāo)記，利用ICP-MS及雙重放大策略實現(xiàn)了3HepG2細(xì)胞(15 細(xì)胞/mL)的最低檢測限，與不使用RCA的Au NPs標(biāo)記方法相比，靈敏度提高了756倍(表4)。

圖5 H9N2病毒免疫分析示意圖[54]

表4 擴增技術(shù)結(jié)合ICP-MS免疫分析的應(yīng)用

3 總結(jié)與展望

縱觀ICP-MS的免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷程，從放射元素、金屬螯合物到骨架聚合物、再到納米粒子標(biāo)記，同時伴有單顆粒檢測模式以及擴增方法的引入，始終不變的前進(jìn)方向是放大檢測信號、提高檢測方法靈敏度。在這幾種方法中，最容易實現(xiàn)的是納米顆粒標(biāo)記法，在其他免疫分析手段中常用的標(biāo)記物如納米金、納米銀、氧化物納米顆粒、量子點等，即使不針對ICP-MS進(jìn)行優(yōu)化也可以取得更好的檢測靈敏度，并且通過單顆粒檢測模式(SP-ICP-MS)可以克服粒徑不均一和溶解元素干擾測定的問題。聚合物標(biāo)記物的主要優(yōu)點在于放大倍數(shù)精確可控、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、基質(zhì)效應(yīng)低，但總的放大倍數(shù)不如其他方法高。擴增技術(shù)在核酸和細(xì)胞檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，且方法較為成熟，目前是發(fā)展最快的一個方向。

對于生物分析來說，高敏分析方法的進(jìn)步更有助于闡明微觀水平(單個細(xì)胞或亞細(xì)胞水平甚至單分子水平[61])上的生命活動過程和機制，因此不斷開發(fā)出靈敏度更高的分析方法具有重要的意義?；贗CP-MS的高靈敏度免疫分析可以降低對樣本量的要求，實現(xiàn)微量樣本的檢測，對于臨床疾病的預(yù)防和診斷也有著重要的作用。