李 欣 李曉琴 李新霞

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

肺癌已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)城市人口生命和健康的疾病，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的75%～80%，其中約75%的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，失去了最佳的治療時(shí)間[1，2]。作為目前臨床上治療非小細(xì)胞肺癌的一線用藥，厄洛替尼(Erlotinib)是一種小分子絡(luò)氨酸激酶抑制劑，能穿過(guò)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)過(guò)量表達(dá)的實(shí)體瘤細(xì)胞膜，并與EGFR分子的酪氨酸結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制酪氨酸激酶的活性，降低腫瘤細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，增加患者對(duì)化療的敏感度[3-5]。因此，厄洛替尼對(duì)存在EGFR敏感突變或既往化療失敗的晚期NSCLC患者是一類(lèi)可供選擇的有效藥物。

與常規(guī)化療相比，厄洛替尼的耐受性較好，其不良反應(yīng)較少而輕，但其主要不良反應(yīng)，如皮疹、腹瀉、肝功能損害、間質(zhì)性肺炎也不能被低估[6,7]。文獻(xiàn)報(bào)道88例服用厄洛替尼治療的患者其血藥濃度相差可達(dá)8倍[8]，可見(jiàn)其藥物動(dòng)力學(xué)存在明顯的個(gè)體差異性，有必要對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。因此，建立一個(gè)快速、靈敏、可靠的方法檢測(cè)人血漿中厄洛替尼的濃度，對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥、實(shí)施個(gè)體化治療十分重要[9-13]。本實(shí)驗(yàn)擬建立相關(guān)高效液相法用于厄洛替尼的生物樣品濃度測(cè)定，并在大鼠體內(nèi)初步研究厄洛替尼的藥物動(dòng)力學(xué)。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；Waters 2489紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器(美國(guó)Waters)；Sigma 2-16K離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；IKA MS3 basic旋渦混合儀(IKA)；HSC-12A氮吹儀(天津恒奧)。

1.2 試劑

厄洛替尼(純度：99%，廣州珠海嘉成醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：183319-69-9)；索拉非尼(純度：99%，南京安格醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)284461-73-0)。其他試劑均為色譜純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雌雄兼半，體重220±20g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)前未服用其他藥物，飼養(yǎng)2周后進(jìn)行試驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均遵照新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指導(dǎo)執(zhí)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

2.1.1厄洛替尼儲(chǔ)備液

精密稱(chēng)取厄洛替尼10mg置100mL量瓶中，加乙醇并定容至刻度，超聲助溶，即得100mg/L的厄洛替尼儲(chǔ)備液。置于4℃冰箱保存，備用。

2.1.2索拉菲尼儲(chǔ)備液

精密稱(chēng)取索拉菲尼10mg置100mL量瓶中，加乙醇并定容至刻度，超聲助溶，即得100mg/L的厄洛替尼儲(chǔ)備液。置于4℃冰箱保存，備用。

2.2 血漿樣品的處理

取血漿200μL置肝素抗凝離心管中，加入50μL(20mg/L)內(nèi)標(biāo)溶液和2mL的處理液(乙腈∶二氯甲烷=4∶1)，超聲助溶10min。3000rpm離心10min。取上清液于45℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22μm微孔濾膜，濾液進(jìn)行HPLC分析。

2.3 測(cè)定方法

2.3.1色譜條件

色譜柱為150mm ×4.6mm C18柱(Waters，Milford，USA)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序： 0～23min，V(A)∶V(B)= 48∶52～25∶75；23～25min，V(A)∶V(B)= 25∶75～48∶52。流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)249nm；進(jìn)樣體積10μL。

2.3.2方法的專(zhuān)屬性

在2.3.1項(xiàng)色譜條件下，將一定濃度的厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，按2.2項(xiàng)下操作，進(jìn)行HPLC分析。同時(shí)對(duì)處理后的空白血漿和大鼠給藥后的血漿樣品進(jìn)行HPLC分析。色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及給藥后的代謝產(chǎn)物不干擾厄洛替尼及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，厄洛替尼和內(nèi)標(biāo)的分離度分別為2.47和1.67。

圖1 血漿中厄洛替尼的色譜圖

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)濃度

取空白血漿200μL準(zhǔn)確加入厄洛替尼儲(chǔ)備液，使其濃度分別為100、1000、3000、4000、6000和7000μg/L，按2.2項(xiàng)下操作，將測(cè)得的厄洛替尼與內(nèi)標(biāo)峰面積比A對(duì)藥物濃度C進(jìn)行線性回歸。回歸方程為C=6515.7A-464.5，r=0.9998。在100～7000μg/L與峰面積比呈良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)濃度為80μg/L (S/N=5)。

2.3.4精密度試驗(yàn)

配制1000、3000和6000μg/L的厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)血樣各6組，于同一日按2.2項(xiàng)下方法處理后作HPLC分析，計(jì)算日內(nèi)精密度；后連續(xù)測(cè)定6天，計(jì)算日間精密度，見(jiàn)表1。由結(jié)果可知，日內(nèi)及日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均遠(yuǎn)小于15%，達(dá)到生物樣品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 精密度結(jié)果

2.3.5回收率試驗(yàn)

厄洛替尼采用1000、3000和6000μg/L為低、中、高3個(gè)濃度，用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法測(cè)得實(shí)測(cè)量，以實(shí)測(cè)量與加入量之比計(jì)算方法回收率；以血樣中厄洛替尼的峰面積與相同濃度厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積之比計(jì)算厄洛替尼的提取回收率，見(jiàn)表2。由結(jié)果可知，方法回收率高、中、低濃度均大于90%，提取回收率方法回收率高、中、低濃度均大于50%。因此，該血漿樣品處理方法及色譜方法可以用于大鼠血漿中厄洛替尼的含量測(cè)定。

表2 回收率結(jié)果

2.3.6樣品穩(wěn)定性

分別考察1000、3000和6000μg/L3個(gè)濃度的厄洛替尼標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品在-20℃的冰箱中放置30d，反復(fù)凍融3次以及血漿樣品按2.2項(xiàng)下處理后用流動(dòng)相復(fù)溶并于室溫下保存24h后的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果表明，血漿中厄洛替尼的含量沒(méi)有發(fā)生明顯變化，結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō)明厄洛替尼具有較好的血漿穩(wěn)定性。

表3 樣品穩(wěn)定性

2.4 血漿樣品采集

取6只SD大鼠，雌雄兼半，實(shí)驗(yàn)前1日禁食12h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日按單劑量方案對(duì)大鼠口服灌胃給予厄洛替尼溶液(15mg/kg)。給藥后自由飲食。給藥前取空白血漿，給藥后分別于2、4、6、8、12、24、36、48、72和144h眼眶靜脈取血漿各400μL，分別置于涂有肝素的離心管中， 10900r/min離心5min，取上層血漿200μL于-20℃保存。6只SD大鼠單劑量口服灌胃給予厄洛替尼后體內(nèi)的平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2，吸收情況與已報(bào)道的替尼溶液代謝過(guò)程基本一致[14,15]。

圖2 SD大鼠單劑量灌胃給予厄洛替尼藥-時(shí)曲線圖

2.5 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以統(tǒng)計(jì)矩分析方法估算6只SD大鼠單劑量口服灌胃給予厄洛替尼后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。SD大鼠口服給予厄洛替尼后的平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)與已報(bào)道的人類(lèi)的相關(guān)數(shù)據(jù)差異較大，可能是由于物種差異性引起。

表4 大鼠給予厄洛替尼后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-UV法測(cè)定厄洛替尼血漿樣品濃度的方法，該方法靈敏、可靠、特異性強(qiáng)，適用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究和治療藥物監(jiān)測(cè)[16-18]。樣品處理時(shí)采用液-液萃取方法，操作簡(jiǎn)單、快速，整個(gè)提取系統(tǒng)的回收率較高，雜質(zhì)干擾也較小，在臨床上和實(shí)驗(yàn)中均有較強(qiáng)的適用性。雖然LC-MS/MS方法較本方法有更低的檢測(cè)限，但極低濃度的血漿厄洛替尼含量檢測(cè)通常只應(yīng)用于毒理學(xué)研究或抑制劑的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，而臨床意義不大，LC-MS/MS方法的檢測(cè)上限僅僅4000μg/L，這就進(jìn)一步限制了該方法的使用。而此前報(bào)導(dǎo)均采用等度洗脫方式，空白血漿對(duì)樣品干擾較大，本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫方式進(jìn)行分離，能有效避免血漿本底的干擾。因此，相較于操作復(fù)雜、耗時(shí)，且價(jià)格昂貴的LC-MS/MS方法，本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-UV方法具有更廣泛的實(shí)用價(jià)值。

此前已有文獻(xiàn)報(bào)道了不同給藥方式的厄洛替尼藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，但較多局限在連續(xù)服用厄洛替尼數(shù)日后或單劑量靜脈給予厄洛替尼的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并無(wú)單劑量口服給予厄洛替尼的相關(guān)報(bào)道[19-21]。因此，本研究不僅可以提供靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，更為臨床用藥提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以期更好地為臨床患者用藥服務(wù)。