劉永玲 葉思帆 楊 怡 方麗紅 趙治兵 謝國芳

(1. 貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州 貴陽 550005；3. 湖南大學，湖南 長沙 410082)

野地瓜又名地果、地枇杷、過山龍、地板藤等，隸屬?？崎艑俣嗄晟橘肽举|藤本。野地瓜為食藥兩用資源，廣泛分布于中國的四川、貴州、廣西、湖南等地，多野生，其果實營養(yǎng)豐富，全株均可入藥，外用可治無名腫毒、燙火傷、止血等，煎藥內服可治風熱咳嗽、痢疾、水腫、黃疽、風濕疼等病癥[1]?，F代研究[2-3]發(fā)現，該屬植物具有降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用。野地瓜含有多種化學成分，包括三萜類、甾醇類、香豆素類、酚苷類、脂肪酸類、烷烴類、多糖類和黃酮類物質[4-5]。雖然已有野地瓜地下根中部分萃取物的抗氧化性報道[6-7]，但未見對野地瓜地上匍匐莖中抗氧化活性及抗氧化活性成分篩選和鑒定的研究報道。

開發(fā)具有抗氧化活性的天然產物成為目前食品和藥物領域的研究熱點，為此尋找各種高效分離和篩選天然產物的方法成為了人們研究的焦點。其中高效液相色譜串聯自由基清除活性化合物檢測系統(HPLC-DAD-DPPH)在線檢測抗氧化活性化合物的方法發(fā)展較快[8-9]，即高效液相色譜(HPLC)柱后在線添加穩(wěn)定的DPPH自由基，提取物經高效液相色譜柱分離后經反應環(huán)，洗脫液中的抗氧化劑與DPPH自由基發(fā)生給質子作用使其在517 nm處的特征吸收峰消失，在色譜圖中形成負吸收峰，實現了粗提物中抗氧化成分的在線篩選和檢測，但對具有抗氧化活性的成分不能快速鑒別。近年來，出現了在線高效液相色譜—質譜—二苯基三硝基苯肼(HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH)技術，即在高效液相色譜串聯自由基清除活性化合物檢測系統篩選抗氧化成分的基礎上，結合質譜在線分析，使天然活性產物一次進樣便能從復雜混合物中在線篩選并鑒別具有清除DPPH自由基作用的化合物，彌補了采用單一技術缺乏抗氧化活性成分快速鑒定能力的不足[10-11]。

為探討野地瓜莖中抗氧化活性成分，試驗擬采用DPPH、ABTS、TRPA 3種體外抗氧化試驗篩選野地瓜莖不同極性萃取提取物，結合HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH技術快速篩選并鑒定有抗氧化活性的成分，以期為野地瓜中抗氧化物質的研究開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野地瓜莖樣品：于2019年2月中旬采自貴州省畢節(jié)市赫章縣白果鎮(zhèn)犀牛唐村高橋組，經貴陽學院楊碧仙教授鑒定為?？崎艑僖暗毓?FicustikouaBur.)的莖；

C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)：WondaSil，日本島津公司；

PEEK盤管(15 m×0.254 mm)：日本島津公司；

三吡啶三吖嗪(TPTZ)、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：美國Sigma公司；

1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)：南京奧多福尼生物科技有限公司；

抗壞血酸、三氯乙酸(TCA)：分析純，上海聚源生物科技有限公司；

綠原酸：純度>97%，中國食品藥品檢定研究院；

新綠原酸、隱綠原酸：純度≥98%，美國斯坦福分析化學品公司；

甲醇：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

試驗用水為超純水：北京嘉遠環(huán)?？萍加邢薰?；

其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：UV-2550型，日本島津公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，配二極管陣列(DAD)檢測器，日本島津公司；

高效液相色譜儀：LC-16型，配UV檢測器，日本島津公司；

質譜儀：X500R QTOF型，美國AB SCIEX公司；

研磨機：A11型，德國IKA公司。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 野地瓜莖浸膏及不同萃取物的制備 取干燥的野地瓜莖(用蒸餾水洗凈泥土，陰干)粉碎，稱取200 g，按液料比20∶1 (mL/g)投料，于80 ℃下用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液后減壓濃縮至無醇味得浸膏50 g，加入100 mL蒸餾水使浸膏充分溶解成混懸液，置于分液漏斗中，依次以兩倍體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分級萃取，直至顏色變淺，得到相應萃取組分和上層被萃取水相，將各萃取液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮后于75 ℃烘箱下烘干，分別得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水相提取物為1.95，3.20，4.06，12.04，18.90 g，即得率分別為0.98%，1.60%，2.03%，6.02%，9.45%，置于4 ℃冰箱內備用。

1.3.2 野地瓜莖不同極性萃取物抗氧化活性測定 分別精密稱定1.3.1條件下的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物，以VC為陽性對照進行抗氧化活性分析。

(1) DPPH自由基清除率：根據文獻[12]。

(2) ABTS自由基清除率：根據文獻[13]。

(3) 總還原力(TRPA)：根據文獻[14]。

1.3.3 溶液的配置

(1) DPPH自由基溶液的配制：稱取DPPH標準品，精密稱定，配制成濃度為25 μg/mL的甲醇溶液，0.45 μm濾膜過濾，現配現用。

(2) 樣品溶液的制備：精密稱定1.3.1條件下野地瓜莖正丁醇萃取物2.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.3.4 色譜與質譜工作條件 HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH在線篩選野地瓜莖正丁醇萃取物中抗氧化活性成分參數及裝置流程參照耿丹丹等[15]的方法并稍作改動。

(1) HPLC-1(LC-20A高效液相色譜儀)工作條件：色譜柱為WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)—0.2%冰乙酸溶液(B)，梯度洗脫程序為0～8 min，20%～25% A；8～13 min，25% A；13～35 min，25%～60% A；35～37 min，60%～20% A；37～43 min，20% A；流速1.0 mL/min；DAD檢測器，檢測波長300 nm；進樣量10 μL；柱溫25 ℃。樣品經HPLC-1色譜柱后分流至HPLC-2的流速0.7 mL/min，HPLC-1色譜柱后分流至質譜的流速0.3 mL/min。

(2) HPLC-2(LC-16高效液相色譜儀)工作條件：反應環(huán)為PEEK盤管(15 m×0.254 mm)；流動相為DPPH甲醇溶液(25 μg/mL)，流速0.45 mL/min，UV檢測器，檢測波長517 nm。

(3) 質譜工作條件：AB SCIEX X500R QTOF質譜儀；電噴霧ESI，正離子模式；離子源溫度550 ℃；離子源電壓5 500 V；MS掃描范圍50～1 500 Da；MS/MS掃描范圍50～1 500 Da；MS誘導碰撞電壓10 V；MS/MS誘導碰撞電壓35 V。

1.4 數據處理

野地瓜莖不同極性組分體外抗氧化活性測定，每個處理進行3次重復試驗。試驗數據用Excel進行整理，測定結果用平均值±標準誤差來表示。自由基清除率試驗的半數抑制濃度IC50值用SPSS 22.0的Probit Regression計算；試驗數據采用IBM SPSS 22.0軟件進行單因素差異分析，以P<0.05為具有統計學顯著差異；GraphPad Prism 7.0、中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統作圖。

2 結果與分析

2.1 野地瓜莖不同極性萃取物抗氧化活性評價

2.1.1 DPPH自由基和ABTS自由基清除作用 野地瓜莖不同極性萃取物與VC經試驗選擇合適的濃度后對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力分別見圖1、2。由圖1、2可知，各極性萃取物均表現出一定的DPPH自由基和ABTS自由基清除活性，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強，表現出劑量相關性。其中正丁醇、乙酸乙酯萃取物和VC在低濃度下就顯示出較好的DPPH自由基和ABTS自由基清除效果。圖1中，VC和正丁醇、二氯甲烷、水相萃取物的濃度分別為16，20，100，200 μg/mL時清除DPPH自由基的能力差異不顯著，說明VC具有較強清除DPPH自由基的能力；根據表1得知正丁醇和乙酸乙酯萃取物對DPPH自由基的IC50值分別為(23.28±0.21)，(38.50±0.38) μg/mL，且VC和正丁醇萃取物對DPPH自由基的IC50差異不顯著，由此得到野地瓜莖不同極性萃取物清除DPPH自由基能力的順序為VC>正丁醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>水>石油醚。圖2中，濃度為100 μg/mL時，各極性萃取物對ABTS自由基的清除率具有顯著性差異(P<0.05)，即正丁醇萃取物對ABTS自由基的清除率分別是VC、乙酸乙酯、二氯甲烷、水和石油醚萃取物的0.78，1.22，3.54，8.52，16.90倍，且根據表1中各極性萃取物的IC50值，得到野地瓜莖不同極性萃取物清除ABTS自由基能力的順序為VC>正丁醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>水>石油醚。這一結果與楊世波等[6]報道的野地瓜根中的抗氧化活性成分主要集中在其乙酸乙酯和正丁醇萃取物中的結論相似。

字母不同表示數據間存在顯著性差異(P<0.05)

字母不同表示數據間存在顯著性差異(P<0.05)

2.1.2 總還原力 抗氧化劑的還原能力與抗氧化活性呈正相關。按照TRPA的測定方法，抗氧化劑的抗氧化活性越高其在700 nm處的吸光度值越高[16]。在測定的質量濃度范圍內(圖3)，野地瓜莖不同極性萃取物與VC均有一定的還原能力，且隨質量濃度的增加而增加，其中正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷萃取物和VC在低濃度下就顯示出較好的還原能力，且在相同質量濃度為50 μg/mL時各極性萃取物具有顯著性差異(P<0.05)，正丁醇萃取物的還原能力分別是VC、乙酸乙酯、二氯甲烷、水和石油醚萃取物的0.7，1.4，2.1，4.1，6.6倍，由此得出各極性萃取物的還原能力大小順序為VC>正丁醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>水>石油醚。這一結果與DPPH自由基、ABTS自由基清除能力表現出一致的抗氧化效果，不同方法活性稍有不同。

表1 野地瓜莖不同極性萃取物和陽性對照VC對ABTS自由基和DPPH自由基的IC50?

字母不同表示數據間存在顯著性差異(P<0.05)

試驗以VC為對照，采用DPPH、ABTS和TRPA 3種化學方法，綜合分析野地瓜莖5種不同極性萃取物的抗氧化活性，篩選出正丁醇萃取物相對于其他極性萃取物具有顯著的抗氧化活性(P<0.05)，3種方法對野地瓜莖不同極性萃取物的抗氧化活性測定是可互換的，故對篩選出的正丁醇萃取物進行抗氧化活性成分的篩選和鑒定。

S1. HPLC-1，DAD檢測器300 nm S2. HPLC-2，UV檢測器517 nm

2.2 野地瓜莖正丁醇萃取物抗氧化成分的在線篩選

分析所測化合物是否具有抗氧化活性是以與DPPH自由基溶液反應，在517 nm下的特征峰消失而形成負峰色譜圖為依據的[17]。試驗對HPLC-1分析的檢測波長進行選擇，考察了正丁醇萃取物在常用的230，254，280，300，360 nm下的吸收情況。結果發(fā)現，正丁醇萃取物在各個波長下的色譜峰基本一致，但具有抗氧化活性化合物形成的負峰在300 nm處吸收更強。因此，選擇HPLC-1的檢測波長為300 nm。如圖4所示，S2中的1、2、3號峰為正丁醇部位信號最強的抗氧化活性成分。

2.3 野地瓜莖正丁醇萃取物抗氧化成分的ESI-MS鑒別

由圖5可知，化合物1～3的準分子離子峰[M+H]+m/z分別為355.102 1，355.102 2，355.101 8，在MS/MS中分別出現了m/z163.038 5，163.038 3，163.038 6的咖啡?；忍卣魉槠x子峰，推斷其分子式為C16H18O9，由于具有相同的碎片離子，推測化合物1～3為綠原酸的同分異構體[18]。依據文獻[19—20]報道，單咖啡?？崴岷投Х弱？崴崴M成的綠原酸異構體共有10種，其中單咖啡?；崴嵊?種，分別為1-O-咖啡?？崴帷?-O-咖啡?？崴帷?-O-咖啡?？崴岷?-O-咖啡?？崴幔侥壳盀橹?，僅有3-O-咖啡?？崴?、4-O-咖啡酰奎尼酸和5-O-咖啡?？崴嵩谥参镏邪l(fā)現。趙玉榮等[21]、Nobuji等[22]報道植物中多同時存在3-O-咖啡?？鼘幩岬漠悩嬻w，其中包含3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩峒?-O-咖啡?？鼘幩?；3-O-咖啡酰奎寧酸異構體在C18柱的洗脫順序為5-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩?。根據文獻[18，21-25]和3種單咖啡?？鼘幩岬某龇鍟r間鑒定化合物1～3分別為5-O-咖啡酰奎寧酸(新綠原酸)、3-O-咖啡酰奎寧酸(綠原酸)和4-O-咖啡?？鼘幩?隱綠原酸)。為了進一步驗證試驗的推測，通過在液相與對照品比對保留時間進一步得到確認。

圖5 5-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩岬腍PLC/ESI-MS正離子模式質譜圖

綜上，根據[M+H]+的相對分子質量以及二級譜圖，結合DAD光譜圖、對照品及相關參考文獻[23-25]，鑒定化合物1～3為5-O-咖啡?？崴帷?-O-咖啡?？崴岷?-O-咖啡酰奎尼酸。野地瓜莖正丁醇萃取物抗氧化活性成分的鑒定結果見表2。

表2 野地瓜莖正丁醇萃取物中抗氧化活性成分分析

3 結論

(1) 采用乙醇回流法提取了野地瓜莖中的活性成分，以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇從野地瓜莖水相混懸液萃取得到不同極性萃取物，綜合3種體外抗氧化試驗(DPPH、ABTS和TRPA)的結果得到野地瓜莖正丁醇萃取物具有顯著的抗氧化活性(P<0.05)。

(2) 采用體外抗氧化性試驗所篩選到的正丁醇部分經在線HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH技術篩選并鑒定出5-O-咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩?種化合物，具有顯著抗氧化能力。由于這類化合物的結構中存在酯鍵、不飽和雙鍵和多元酚，在提取過程中，往往會通過水解和分子內酯基遷移而發(fā)生異構化，如3-O-咖啡酰奎寧酸酯鍵斷裂產生奎尼酸峰(m/z191)和咖啡?；?m/z163)，咖啡?；诳崴嵘系牟煌〈纬闪瞬煌难苌?，因此課題組后期對這3種活性抗氧化化合物進行分離時應注意提取工藝的優(yōu)化。

(3) 在線高效液相色譜—質譜—二苯基三硝基苯肼(HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH)技術的出現對天然抗氧化活性成分的快速篩選和解析提供了新的途徑，與體外抗氧化試驗表現出互補優(yōu)勢。后期研究中，將對野地瓜莖正丁醇部分3種抗氧化活性化合物進行進一步分離、純化以及鑒定。