黃瓊蘭，胡靜榮，邢淇瑋，胡晶晶，楊 珍，張慧娟*

(1.中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074；2.中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與實(shí)驗(yàn)室管理中心，湖北武漢 430074)

內(nèi)分泌干擾化合物具有和內(nèi)分泌激素類似的生理作用，長期接觸即使是低劑量也會使人體代謝紊亂，進(jìn)而可能引發(fā)糖尿病、肥胖、心血管疾病甚至癌癥[1,2]。雙酚A(BPA)作為塑料生產(chǎn)的重要原料，因其具有雌激素活性，成為近十年來最受關(guān)注的雙酚類內(nèi)分泌干擾物[3 - 5]。加拿大和歐盟都已經(jīng)禁止在嬰兒奶瓶材質(zhì)中添加BPA，以減少其對嬰幼兒健康的危害[6,7]。研究表明，具有與BPA類似結(jié)構(gòu)的其它雙酚類化合物(BPs)，如雙酚S(BPS)、雙酚F(BPF)和雙酚AF(BPAF)等，也具有雌激素活性，且已在地表水、沉積物、室內(nèi)灰塵和人體尿液中被檢出[8,9]。目前對于雙酚類化合物的檢測方法主要是各類色譜分離技術(shù)與高靈敏檢測器聯(lián)用，例如氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11]和電化學(xué)發(fā)光傳感器法[12]。由于雙酚類化合物在實(shí)際樣品中的含量低且樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此，建立高效，快速的樣品前處理與色譜分離聯(lián)用技術(shù)尤為重要。

磁固相萃取因其萃取效率高且易于分離回收的優(yōu)點(diǎn)，在樣品前處理技術(shù)中發(fā)揮著重要的作用[13]。殼聚糖是天然環(huán)境友好的高分子材料，其在重金屬污染治理領(lǐng)域中有著不俗表現(xiàn)[14 - 17]，此外對雙酚類物質(zhì)如BPAF有較好的去除效果[18]。但是殼聚糖材料機(jī)械強(qiáng)度差，極性基團(tuán)過多且不易回收，我們課題組就此進(jìn)行改善，制備了磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料，其對BPA具有很好的富集性能[19]。本文以磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料為分離富集材料，以高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)為分離檢測手段，建立了同時(shí)測定包括BPA、BPS、BPF、BPAF以及四氯雙酚A(TCBPA)5種雙酚類化合物的分析方法。結(jié)果表明，磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料對5種目標(biāo)BPs均具有優(yōu)良的富集能力。在最佳的富集條件下，5種BPs的檢出限范圍為2.34～15.6 μg/L，且方法的精密度好。方法用于茶飲樣品中可能存在的雙酚類化合物的檢測，顯示茶飲基質(zhì)不會影響B(tài)Ps的富集。我們所建立的分析方法準(zhǔn)確性較好，可以用于檢測茶飲品中的BPs。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)(美國，安捷倫科技有限公司)，配二極管陣列檢測器(DAD)；50 μL微量進(jìn)樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)。

雙酚S(BPS，99%)，雙酚F(BPF，99.0%)，雙酚A(BPA，99.0%)，雙酚AF(BPAF，98%)，四氯雙酚A(TCBPA，98%)，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。采用甲醇配制BPF、BPA、BPAF和TCBPA標(biāo)準(zhǔn)儲備液，各標(biāo)液濃度為1.0 g/L。BPS的標(biāo)準(zhǔn)儲備液為0.1 g/L。所有標(biāo)準(zhǔn)儲備液4 ℃避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成不同濃度。甲醇和乙腈均為色譜純，購于美國Tedia公司。其它試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：WondaSilTM C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm；日本，Shimadzu公司)；流動(dòng)相A為乙腈，B為超純水。梯度洗脫程序：0～5 min，40%～80%A；5～9 min，80%A；9～19 min，80%～100%A；19～20 min，100%～40%A；流速：1.0 mL/min。紫外檢測波長為：225 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。每次進(jìn)樣前，采用40%A平衡10 min。

1.3 磁固相萃取流程

磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料由本課題組自制[19]。磁固相萃取流程如下：準(zhǔn)確稱取一定量的磁性復(fù)合材料于PTFE離心管中，用5 mL水/甲醇混合溶液(體積比95/5)對材料進(jìn)行清洗，然后用甲醇對其進(jìn)行活化，N2氣吹干。加入10.00 mL含有一定濃度的BPS、BPF、BPA、BPAF和TCBPA的標(biāo)準(zhǔn)混合液，在室溫下用渦旋儀渦旋一段時(shí)間，待富集結(jié)束后進(jìn)行磁性固液分離，用水清洗材料除去殘液。N2氣吹干后加入2 mL的洗脫劑，渦旋10 min進(jìn)行洗脫，再次磁性分離，取清液10 μL進(jìn)行HPLC分析檢測。富集率(%)由(W/W0)×100計(jì)算，其中W0、W(mg)分別為富集前及洗脫后溶液中每種BPs的質(zhì)量。

1.4 茶飲樣品預(yù)處理

塑料瓶裝品牌茶飲A和B均購于超市，規(guī)格均為500 mL。將瓶裝茶飲連瓶置于90 ℃水浴鍋中加熱10 min后，取出自然冷卻，待用。品牌C和D為茶包，分別放入裝有250 mL的90 ℃水的燒杯中，浸泡10 min，取出茶包，自然冷卻。冷卻茶水均用高濃度且pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋，最終茶飲樣品中PBS的濃度為20 mmol/L。在最優(yōu)條件下利用復(fù)合材料進(jìn)行磁固相萃取，洗脫液待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液pH值和鹽濃度對富集率的影響

樣品溶液的pH值可能會影響5種BPs的存在形式，以及磁性C12殼聚糖硅膠復(fù)合材料表面電荷的種類和密度，進(jìn)而影響復(fù)合材料對BPs的富集。由于材料中SiO2成分于強(qiáng)酸強(qiáng)堿中不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)在pH=4.0～9.0范圍內(nèi)考察了pH值對材料富集性能的影響，5種BPs的濃度均為0.5 mg/L(此濃度也是后續(xù)其它條件考察時(shí)所用濃度)。從圖1(a)的結(jié)果來看，在pH=4.0～6.0之間，當(dāng)pH=6.0時(shí)，5種BPs物質(zhì)的富集量達(dá)到最大；當(dāng)pH>6.0后，BPF、BPA和BPAF的富集量基本沒有變化，TCBPA的富集量略下降，而BPS的富集量大幅度減小。究其原因可能是BPS的pKa為8.2[2]，在堿性條件下易電離，pH越大，BPS離子化程度越高，從而導(dǎo)致材料與BPS之間的疏水作用力減小，富集效果變差。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH=6.0為后續(xù)實(shí)驗(yàn)溶液的pH值。

圖1 pH值(a)和鹽濃度(b)對萃取性能的影響。磁性材料用量：50 mg；洗脫劑：2 mL的乙腈；誤差棒為3次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.1 Influence of pH value (a) and salt concentration (b) on the extraction.A mass of magnetic composite:50 mg;Eluent:2 mL of acetonitrile;the error bars represent standard deviation of three parallel experiments

溶液鹽濃度可以改變吸附劑表面的電荷密度和溶液的離子強(qiáng)度，可能會影響富集材料對5種BPs的吸附行為。實(shí)驗(yàn)中選擇NaCl調(diào)節(jié)溶液鹽濃度，考察鹽濃度對磁固相萃取的影響。在考察的鹽濃度范圍(0～150 mmol/L)內(nèi)，復(fù)合材料對5種BPs的富集基本不受鹽濃度的影響(圖1(b))。

2.2 材料用量及富集時(shí)間對萃取性能的影響

采用適量的吸附劑、提供足夠的吸附位點(diǎn)才能保證每種BPs都達(dá)最佳的富集量。由圖2(a)可知，隨著吸附劑用量的增加，BPAF和TCBPA的富集量很快達(dá)到平衡，而BPS、BPF和BPA的富集量隨磁性復(fù)合材料用量的增加而增大。當(dāng)材料用量達(dá)到40 mg后，5種BPs的富集量基本保持不變。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用50 mg磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料。同時(shí)，我們對富集時(shí)間也進(jìn)行了考察。從圖2(b)可以看到，5種BPs富集20 min后均達(dá)到平衡。因此，選擇20 min為后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要的富集時(shí)間。

圖2 材料用量(a)及富集時(shí)間(b)對萃取性能的影響。洗脫劑：2 mL的乙腈；誤差棒為3次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.2 Influence of the amount of sorbent (a) and enrichment time (b) on the extraction.Eluent:2 mL of acetonitrile;the error bars represent standard deviation of three parallel experiments

2.3 洗脫條件的考察

以乙腈為洗脫劑，考察洗脫劑用量和洗脫時(shí)間對材料洗脫的影響。5種BPs的洗脫率隨乙腈用量的增大而增大，當(dāng)乙腈洗脫體積達(dá)到2 mL時(shí)，BPS、BPF、BPA、BPAF和TCBPA的洗脫率分別是98.1%、97.0%、97.9%、96.8%和96.6%(圖3(a))。從環(huán)保和提高富集倍數(shù)考慮，2 mL是最合適的洗脫劑用量。隨后考察了洗脫時(shí)間的影響，結(jié)果如圖3(b)所示。洗脫時(shí)間為5 min時(shí)，5種BPs的洗脫率已超過96%，洗脫迅速。為了保證分析方法的重現(xiàn)性，最終選擇10 min為最佳洗脫時(shí)間。

圖3 洗脫體積(a)和洗脫時(shí)間(b)對萃取性能的影響。磁性材料用量：50 mg；樣品體積：10 mL；誤差棒為3次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.3 Influence of elution volume (a) and elution time (b) on the extraction.A mass of magnetic composite:50 mg;sample volume:10 mL;the error bars represent standard deviation of three parallel experiments

2.4 分析方法評價(jià)及樣品分析

基于反相色譜分離機(jī)理，以乙腈和水的混合溶液作為二元流動(dòng)相，優(yōu)化了色譜分離條件并實(shí)現(xiàn)了5種BPs的基線分離。在最佳的色譜條件下，測定5種BPs的線性方程、線性范圍和檢出限(LODs)如表1所示。5種BPs在各自的線性范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R超過了0.99。BPS的線性范圍略窄的原因可能是因?yàn)槠錁O性較大，在高濃度時(shí)材料對其富集不完全造成的。

表1 分析方法的線性范圍、線性相關(guān)性、精密度及檢出限

平行分析7次BPs標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(0.05 mg/L)后，計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S，以3S作為檢出限，5種BPs的檢出限為2.34～15.6 μg/L。方法的精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，RSDs在1.5%～8.5%之間。與類似的富集材料相比[20,21]，基于磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料建立的分析方法的檢出限較低，靈敏度較高。

包裝是保證食品質(zhì)量和安全的屏障。而塑料包裝的茶飲或茶包加熱后，包裝中的BPs可能遷移到茶飲中，從而被人體攝入，因此建立檢測茶飲基質(zhì)中的雙酚類化合物含量具有一定的挑戰(zhàn)。我們對4種茶飲進(jìn)行了加標(biāo)分析，兩個(gè)不同加標(biāo)濃度的回收率列于表2。通過圖4的茶飲加標(biāo)樣品色譜分離圖，可以看到茶飲基質(zhì)對BPs色譜峰的定量沒有干擾。在4種茶飲中，5種BPs的加標(biāo)回收率在86.0%～112.3%之間，RSD不超過4.23%。4種茶飲中均未檢測到BPs，考慮到瓶裝茶飲加溫時(shí)間和茶包沖泡時(shí)間可能過短，從而導(dǎo)致包裝中存在的BPs未遷移至茶飲中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會做進(jìn)一步研究。

圖4 茶飲A及其加標(biāo)分析的色譜分離圖。(a)茶飲A中添加BPS的濃度為0.4 mg/L，其它4種為2 mg/L；(b)茶飲A中5種BPs的濃度均為0.2 mg/L；(c)茶飲A的空白Fig.4 Chromatograms of blank and spiked tea drink A.(a) The spiked concentration of BPS was 0.4 mg/L and other BPs was 2 mg/L;(b) the spiked concentration of each BPs was 0.2 mg/L;(c) the blank of tea brink A

表2 4種市售茶飲中BPS、BPF、BPA、BPAF和TCBPA加標(biāo)回收率的測定

3 結(jié)論

本文基于磁性C12烷基殼聚糖硅膠復(fù)合材料成功建立了以磁性固相萃取為富集方法，高效液相色譜-二極管陣列檢測為分離檢測手段，高效、準(zhǔn)確測定5種BPs的分析方法。建立的分析方法應(yīng)用于茶飲樣品的分析，雖然在4種茶飲中均未檢測到BPs，但分析方法的回收率在86.0%～112.3%之間，表明該方法準(zhǔn)確性好。