秦偉瀚，李曉明，陽 勇，李 卿*

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(EupatoriumlindleyanumDC.)的干燥地上部分[1]，為2015年版《中國藥典》所收錄[2]。本品味苦、性平，歸肺經(jīng)，具有化痰、止咳、平喘之功效，常用于治療痰多、咳嗽、氣喘等病癥[3，4]?；瘜W(xué)成分研究表明，野馬追主要含有黃酮、生物堿、萜類、甾醇類等成分[5 - 9]。林澤蘭內(nèi)酯B屬于愈創(chuàng)木烷型倍半萜，是野馬追的主要生物活性物質(zhì)[10]，且含量頗高。目前尚無林澤蘭內(nèi)酯B藥效、毒性的相關(guān)文獻報道，對其研究稍顯遲滯。因此，研究林澤蘭內(nèi)酯B及其代謝產(chǎn)物，明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對于中藥材野馬追的臨床使用和新藥開發(fā)等具有重要意義。

超高效液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)可以提供良好的分離效果及強大的結(jié)構(gòu)表征能力，已廣泛運用于中藥復(fù)雜成分研究，以及環(huán)境分析、中藥代謝、藥物分析等領(lǐng)域，不僅可以避免繁瑣、耗時的分離純化過程，而且能分離鑒定以往難于辨識的痕量藥物及代謝物[11 - 15]。本研究以探究大鼠血清中林澤蘭內(nèi)酯B的代謝產(chǎn)物為目標，采用高分辨質(zhì)譜，基于多重質(zhì)量虧損和動態(tài)背景扣除技術(shù)，系統(tǒng)分析了林澤蘭內(nèi)酯B在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程，為明確中藥材野馬追的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及深入開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

LC-30A型超高效液相色譜儀(日本，島津公司),附二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱；Triple TOFTM4600型四極桿串聯(lián)飛行時間-高分辨質(zhì)譜儀(美國，AB公司)，附Analyst1.6工作站、PeakView 1.2.0.3數(shù)據(jù)處理軟件、MetabolitePilot 1.5.0.8532代謝產(chǎn)物鑒定軟件；DW-86L486型超低溫冰箱(中科美菱公司)；Microfuge 20R型超高速離心機(美國，貝克曼庫爾特公司)。

林澤蘭內(nèi)酯B對照品為自制，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)歸一化法測定，純度>98%。乙腈、甲醇、水(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國ACS公司)。

1.2 實驗動物及林澤蘭內(nèi)酯B灌胃給藥

SD大鼠，SPF級，10只，雄性，體重200±20 g，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0006，動物合格證號：0003054)。動物飼養(yǎng)于重慶市中藥研究院藥化所，動物實驗環(huán)境(溫度20～25 ℃，濕度50%～65%)。自由攝食和飲水。飼養(yǎng)3 d后禁食12 h，自由飲水。按照5 mg/kg劑量灌胃，分別于給藥后30、60、90、120、180、240 min眼眶靜脈取血0.5 mL，置于裝有肝素鈉的EP管中，以12 000 r/min離心10 min后，取上層血清，于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3 樣品采集與處理

按照采血時間點，精密吸取10只大鼠血清樣品各50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入甲醇100 μL后，渦旋混勻2 min，12 000 r/min離心10 min，分別吸取上清液和空白對照液2 μL，進行UPLC-TOF-MS分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度程序：0～1.0 min，5%B；1.0～11.0 min，5%～85%B；11.0～12.0 min，85%B；12.0～12.1 min，85%～5%B；12.1～15.0 min，5%B；流速：0.2 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，負離子掃描(ESI-)模式采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓(IS)：-4 500 V；霧化氣壓力(GS1)：0.31 MPa；氣簾氣壓力(CUR)：0.14 MPa；輔助氣壓力(GS2)：0.34 MPa；離子源溫度：650 ℃；簇裂解電壓(DP)：50 V；碰撞能量(CE)：45 eV；檢測模式為信息關(guān)聯(lián)采集模式(IDA)，多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級質(zhì)譜的條件，滿足該條件優(yōu)先進行二級質(zhì)譜掃描。

1.5 代謝產(chǎn)物分析鑒定

采用ChemDraw軟件建立林澤蘭內(nèi)酯B的mol格式文件，導(dǎo)入PeakView軟件，結(jié)合Formula Finder、Mass Calculators等功能，對林澤蘭內(nèi)酯B標準品及含藥血清樣品進行定性分析，并將上述結(jié)果代入MetabolitePilot軟件，對林澤蘭內(nèi)酯B入血后產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物進行分析鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 林澤蘭內(nèi)酯B鑒定分析

采用UPLC-TOF-MS對林澤蘭內(nèi)酯B樣品進行分析。如圖1、圖2所示，林澤蘭內(nèi)酯B在ESI+模式中的母離子[M-H]-為m/z359.1496，經(jīng)質(zhì)譜電離裂解作用分別脫去116.0496 Da、244.1125 Da生成了m/z為243.1000、155.0371的碎片離子，再m/z243.1000的碎片離子脫去43.9907 Da生成m/z199.1093的離子，利用PeakView軟件的Mass Calculators功能計算出C5H8O3、C15H16O3、CO2的理論值分別為116.04680 Da、244.10940 Da、43.98928 Da，與脫去碎片的實際值之差均小于0.01 Da。通過上述對二級碎片裂解規(guī)律的分析并結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)特點，判定該化合物即為林澤蘭內(nèi)酯B。

圖1 林澤蘭內(nèi)酯B的提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.1 Extraction ion Chromatograms(XIC) and MS/MS of eupalinilide B(a) XIC of standard product;(b) MS/MS of standard product;(c) XIC of serum;(d) MS/MS of serum.

圖2 林澤蘭內(nèi)酯B裂解規(guī)律圖Fig.2 Pyrolysis chart of eupalinilide B

將林澤蘭內(nèi)酯B分子式(C20H24O6)代入PeakView軟件的XIC Manager篩查表中對該化合物保留時間、強度等質(zhì)譜參數(shù)進行提取處理；由圖1a、1c可知，標準品在5.931 min處有超過100 000 cps響應(yīng)，而血清樣品在5.939 min處有接近20 000 cps響應(yīng)，進一步對其MS/MS碎片進行比較分析(如圖1b、1d)，發(fā)現(xiàn)兩者的裂解碎片的m/z基本一致，據(jù)此判斷血清樣品中含有林澤蘭內(nèi)酯B。由數(shù)據(jù)處理結(jié)果可知，入血后離子強度為灌胃標準品的1/5，表明林澤蘭內(nèi)酯B的生物利用度較高，該類化合物應(yīng)有較高的開發(fā)利用價值。

2.2 林澤蘭內(nèi)酯B大鼠體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化分析

采用ChemDraw軟件建立林澤蘭內(nèi)酯B的mol格式文件，導(dǎo)入MetabolitePilot軟件中，獲取該化合物理論裂解參數(shù)，再將標準品的Q-TOF數(shù)據(jù)作為血清樣品的參比對照導(dǎo)入該軟件，以2.1項下的保留時間、二級碎片等分析結(jié)果對林澤蘭內(nèi)酯B實際質(zhì)譜信息進行篩選匹配，建立該化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；MetabolitePilot軟件會自動對以林澤蘭內(nèi)酯B為母核的所有代謝產(chǎn)物進行分析處理，再結(jié)合相應(yīng)代謝產(chǎn)物的二級碎片進行補充鑒定，代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果見表1、圖3。

表1 林澤蘭內(nèi)酯B代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果

(續(xù)表1)

圖3 林澤蘭內(nèi)酯B代謝過程圖Fig.3 Metabolic process diagram of eupalinilide B

通過大鼠體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化分析研究，以林澤蘭內(nèi)酯B為原型共鑒定出了26種代謝產(chǎn)物，其中Ⅰ相代謝包括氫化、氧化、水解、成酮、脫氧、甲基化等8種反應(yīng)類型；Ⅱ相代謝包括葡萄糖苷結(jié)合、葡萄糖醛酸結(jié)合、乙?；?、磷酸化、谷胱甘肽結(jié)合、谷氨酰胺結(jié)合共6種反應(yīng)類型；有15種代謝產(chǎn)物發(fā)生水解反應(yīng)，可見水解是主要代謝過程，與化合物原型含有1個酯鍵和1個內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)特征相符；Ⅰ相代謝中氧化反應(yīng)較多，可以是加氧、成酮或成羧酸，而還原反應(yīng)以不飽和雙鍵加氫為主；單獨的Ⅱ相反應(yīng)只有谷胱甘肽結(jié)合(M10)、葡萄糖醛酸結(jié)合(M8)，其余4個發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物均伴隨了Ⅰ相水解反應(yīng)。由此可見Ⅰ相反應(yīng)過程通過氧化、還原、水解在林澤蘭內(nèi)酯B分子結(jié)構(gòu)中引入或脫去功能基團從而發(fā)揮藥效活性或失去活性；Ⅱ相反應(yīng)則通過與內(nèi)源性物質(zhì)經(jīng)共價鍵結(jié)合，生成極性大、水溶性高的結(jié)合物，經(jīng)尿液排泄。

2.3 林澤蘭內(nèi)酯B量時變化分析

由量時曲線(圖4)可以看出，當采血時間為灌胃后30 min時，血清樣品中林澤蘭內(nèi)酯B峰面積達到最大值為94 500；當采血時間為60 min時，林澤蘭內(nèi)酯B的峰面積稍有降低為76 095；而在90 min時，峰面積降低至最大值的一半(50 030)；之后直到240 min血清樣品，林澤蘭內(nèi)酯B峰面積僅小幅波動，可能與藥物吸收代謝特性及血清樣品的基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)。通過量時變化趨勢分析，初步探討發(fā)現(xiàn)，林澤蘭內(nèi)酯B生物利用度較高，該成分與藥效活性密切相關(guān)。

圖4 林澤蘭內(nèi)酯B量時曲線圖Fig.4 Mass spectrometric response intensity and time curve of eupalinilide B

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，基于多重質(zhì)量虧損和動態(tài)背景扣除技術(shù)，結(jié)合PeakView、MetabolitePilot軟件，對林澤蘭內(nèi)酯B在大鼠體內(nèi)的生物過程進行系統(tǒng)分析，共鑒定出24種代謝產(chǎn)物，其中Ⅰ相水解反應(yīng)是主要代謝過程；在采血時間為30 min的時候，林澤蘭內(nèi)酯B的離子強度達到最高值，之后逐漸降低，初步探討發(fā)現(xiàn)，林澤蘭內(nèi)酯B生物利用度較高，該成分與藥效活性密切相關(guān)，課題組擬在后期對該活性成分進行藥代動力學(xué)深入分析。野馬追的主要化學(xué)成分包括黃酮類、萜類、生物堿、甾醇類等，其中林澤蘭內(nèi)酯B是屬于愈創(chuàng)木烷型倍半萜類的一種，是野馬追主要特征有效成分。本研究在對林澤蘭內(nèi)酯B化學(xué)結(jié)構(gòu)進行定性解析的基礎(chǔ)上，采用MetabolitePilot軟件對林澤蘭內(nèi)酯B的所有代謝產(chǎn)物進行快速分析鑒定，極大簡化了中藥復(fù)雜成分、復(fù)雜代謝過程的數(shù)據(jù)處理流程，為明確野馬追的體內(nèi)起效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新思路，也為野馬追的新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用等提供科學(xué)參考。