謝玲玲，周火強，弭寶彬，倪向江，陳玲歡

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙 410125；2. 長沙市農產品質量監(jiān)測中心，湖南 長沙 410003）

EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）是 一種烷化劑，其誘變機理是通過與核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反應來誘發(fā)突變。EMS 誘發(fā)形成突變體主要通過兩個步驟完成：首先鳥嘌呤的C6 位置被烷基化，而后在DNA 復制過程中，烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，導致堿基交換，即G：C 變?yōu)锳：T，形成點突變[1]。采用EMS 作為誘變劑，具有易操作、成本低、專一性強，產生點突變頻率高，出現染色體畸變頻率低等優(yōu)勢[2]。EMS 作為一種高效、穩(wěn)定的化學誘變劑，是當前構建大規(guī)模飽和突變體庫的理想誘變方法[3-5]，目前在誘變育種中應用最為廣泛，效果也最好。

早在20 世紀60 年代，人們就已開始采用EMS 水溶液處理植物種子，但誘變效率很低。自Neuffer等將EMS 溶于石蠟油中處理玉米花粉獲得成功后，石蠟油-EMS 處理花粉誘變技術在國外廣泛應用起 來[6]。我國于80 年代末期開始進行EMS 誘變研究。杜連恩等研究發(fā)現，平陽霉素（PYM）后處理能提高甲基磺酸乙醋（EMS）的誘變效果。試驗結果證明，EMS 處理小麥濕種子附加PYM 后處理的MZ 代植株誘變頻率為8.9%～19.2 %，較EMS（5.7%）單獨處理的效果提高了1.5～3.0 倍。此為我國有文獻報道的最早的EMS 誘變相關的研究，進入21 世紀后，我國EMS 誘變研究迅速發(fā)展。

1 EMS 誘變材料

EMS 誘變可選取的材料十分廣泛，除模式作物擬南芥外，幾乎涵蓋了整個植物界，其中糧食類作物如水稻、玉米、小麥、高粱、蕎麥、馬鈴薯等；經濟作物如油菜、大豆、棉花、煙草、木薯、亞麻薺、花生、芝麻、甘蔗、花椒等；蔬菜類如大白菜、冬瓜、黃瓜、苦瓜、茄子、芥菜、番茄、卷心菜、豇豆、山藥、紫蘇等；水果類如西瓜、獼猴桃、甜橙、草莓、菠蘿、越橘等；花卉類如蘭花、長春花，藍花丹等；樹木類如楊樹等；草類如狗牙根、黃花苜蓿、蒺藜苜蓿、扁蓿豆、紅豆草、多枝賴草、高羊茅等，藥用植物如黨參等；菌類如枯草芽孢桿菌、酵母等；藻類如三角褐指藻、小球藻等；甚至于原生質體也已成為EMS 誘變的材料。

2 誘變方法

采用EMS 誘變的方法較多，包括種子誘變、花粉誘變、離體誘變等[7]，誘變的部位也因植物種類而異。研究者通常根據作物的繁殖方式和染色體倍數來選擇誘變的部位，比如種子、花藥、花粉、塊莖和葉片等。一般作物的化學誘變最常用的供試材料是種子和花粉，也可采用愈傷組織。誘變材料的處理途徑根據供試材料的不同有所差別，常用的途徑有浸泡法（種子、芽）、滴液法（莖）、注射法（花器）、涂抹法（花絲、莖）和共培養(yǎng)法（根、花藥）等[8]。

不同的物種對EMS 的敏感程度不同，對 EMS 的濃度、處理溫度和處理時間的反應效應也不同，必須通過預備試驗來確定EMS 誘變的最佳劑量[9]。另外，同一物種不同的組織或器官對EMS 的敏感程度也不一樣，因此，無論采用哪種誘變方法，以什么物種、組織或器官作為供試材料，都需要先設置一系列梯度的濃度和時間進行處理，然后從中選用最適宜的誘變劑量（誘變劑量=誘變液濃度×處理時間），最佳誘變劑量取決于EMS 誘變濃度和處理時間的組合[8]。一般情況下，EMS 濃度越低，處理時間越短，對供試材料產生的生物學損傷越小，誘變率也越低，隨著 EMS 溶液濃度的提高，誘變率相對增加，對供試材料產生的生物學損傷也隨之變大，若致死率過高，則誘變失去意義。因而在確定最佳誘變劑量時，既要保證對種子不會損傷過大，又能獲得較豐富的變異。目前，普遍采用半致死劑量進行大量誘變處理，再通過后代篩選獲得突變體。

2.1 種子誘變

種子作為植物繁衍后代最主要的器官，成為EMS 誘變處理最主要的材料。用EMS 處理植物種子操作簡單，受外界環(huán)境因素影響小，且容易獲得較大的突變體群體[9]。目前采用種子進行誘變的報道較多，材料涉及面廣，包括糧食作物、經濟作物、蔬菜、水果花卉等。譚義川等[10]采用20% PEG-6000 室內模擬干旱環(huán)境對EMS 化學誘變獲得的19 份玉米M4 代誘變系進行干旱脅迫，篩選出4 個抗旱性較好的誘變系。張貞彩等[11]通過對1.2%EMS 處理的濟麥20、濟麥22 誘變群體M3 單株種子理化特性的分析，發(fā)現2 個小麥品種誘變材料糊化粘度變異程度、變化趨勢均不同，可形成不同品質、不同功能的淀粉材料，為小麥淀粉品質改良提供了理論和材料基礎。杜園園等[12]采用EMS 處理大豆品種長豆18 和黑豆品種長豆006種子，結果表明長豆18 的適宜誘變條件以浸種4 h，EMS 處理濃度0.5%，誘導時間8 h 和浸種4 h，處理濃度0.5%，EMS 誘導時間12 h 處理最優(yōu)；黑豆品種長豆006 的適宜誘變條件為浸種4 h，處理濃度0.5%，EMS 誘導時間為8 h。

2.2 花粉誘變

花粉誘變是獲取突變體的另一有效途徑。利用EMS 進行花粉誘變最早始于國外，1986 年，美國ICI種子公司Greaves 等用含有EMS 的石蠟油處理玉米自交系成熟花粉，獲得抗除草劑突變體。1991 年張銘堂利用EMS 處理玉米花粉，發(fā)現糯質基因WX 的誘變頻率為 0.12%，后來蒙坦拿大學從Victor Roboy EMS花粉誘變后代中選出2 個高油突變體[13]。此后，國內一些育種單位逐漸意識到EMS 花粉誘變技術的重要性，并相繼開展了相關研究。陳紹紅等從1998 年開始，以農大108 玉米為材料，將其花粉用石蠟油進行懸浮處理，經M1 代測定，于2001 年獲得高油突變體15 個。劉治先[14]用EMS 花粉誘變技術篩選出兩類高油酸玉米突變體，為特用玉米育種和遺傳研究提供了可貴的材料。

2.3 離體誘變

離體誘變處理的對象包括原生質體、單細胞、愈傷組織、懸浮細胞、小孢子單核靠邊期的花藥、莖尖或頂端分生組織、處于分生發(fā)育初期的腋芽，以及植物組織或器官的外植體等。國內外已有較多對植物進行EMS 離體誘變研究的相關報道，主要涉及果樹和花卉等領域，所研究植物包括木薯、草莓、海棠、黨參、花生、蘭花、水仙、甜葉菊、唐菖蒲等。石淑穩(wěn)等[15]用0.2%和0.25% EMS 處理小孢子胚狀體3～5 h 均可獲得突變體。和江明等[16]用EMS 溶液和秋水仙素先后處理甘藍型油菜的小孢子，得到了一份油酸含量達80%以上的高油酸突變材料。陸榮生等[17]用EMS 處理木薯品種“桂熱-893”組培苗葉片產生的愈傷組織，通過在愈傷增殖、分化及生根培養(yǎng)基中添加一定濃度的草甘膦作為選擇壓力，進行抗草甘膦植株離體篩選，共獲得5 個抗草甘膦無性系，其中2 個無性系對草甘膦有明顯抗性。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，離體誘變可在短期內加強個別性狀的變異，提高變異頻率和擴大變異范圍，并可使誘變、選擇、快繁同時進行，使誘變技術更為有效[18]。

2.4 理化復合誘變

理化復合誘變是指利用 2 種或2 種以上物理、化學因子依不同處理順序處理植物材料進行誘變。其常用的方式為先輻照植物種子，再用含有化學誘變劑的溶液浸泡。復合誘變可采用多種物理、化學組合因子進行處理，其中以γ 射線+EMS 復合處理為最常用的組合方式[19]。由于射線改變了生物膜的完整性和滲透性，從而有助于化學誘變劑的吸收。已有試驗證明，適宜的復合誘變及其劑量組合具有明顯的累加效應或超累加效應(協(xié)合效應 )。劉艷萌等[20]以“全明星”草莓組培苗為試材，分別用甲基磺酸乙酯（EMS）、60Co-γ 射線以及Co-γ 射線+ EMS 的復合誘變劑對葉片進行處理，并對“全明星”草莓進行初步耐鹽篩選，結果表明，復合誘變處理再生植株的生物產量和耐鹽性顯著高于其他處理。熊大勝[21]等用γ 射線及EMS誘變三葉木通種芽，發(fā)現二者復合處理能產生早實變異，童期13 個月，比對照縮短12 個月以上，也能產生早熟變異，比對照縮短2 個月以上。Arumugam 等[22]以γ 射線與 EMS 復合處理大麥種子，得出大麥類型SMV-2 比K-168 對復合處理更敏感。鄧占鰲等[23]用γ射線和EMS 誘變柑桔，獲得了“錦橙”和“桃葉橙”的耐鹽突變系。

3 EMS 誘變效應分析

EMS 化學誘變可誘發(fā)任意一個基因位點發(fā)生突變，即誘變具有非定向，因此其對植物產生的影響幾乎涉及植物的所有組織和器官，從表觀上來看，植物從內到外、從上到下的特征特性都有可能發(fā)生改變。

EMS 誘變使植物產生的變化多種多樣。從表1 可以看出，通過EMS 誘變后，植物的莖、葉、花、果實、種子、卷須、發(fā)育期等都可發(fā)生明顯的變異。相比于其他器官，葉、花、果實突變頻率較高，且變異類型十分豐富。葉部的突變涉及葉的形狀、顏色、形 態(tài)等，其中葉的黃化突變產生頻率較高，如冬瓜、西瓜、辣椒等都有產生?；ǖ耐蛔兩婕邦伾?、形狀、以及育性，果實的突變涉及果實顏色、形狀、形態(tài)等。目前，尚未見有根部突變的相關報道，原因可能是根部器官在研究中暫時未作為重點引起關注，也可能其本身發(fā)生變異概率小，且根系生長于土壤中不易被觀察。

從EMS 誘變引起的這些突變性狀來看，多數突變對于實際生產應用沒有太大的意義，其中很少一部分能直接作為育種材料使用，但這些突變材料卻能為植物種質資源創(chuàng)造、突變體庫建立、功能基因組學研究等方面發(fā)揮重要作用[24]。

表1 EMS 誘變產生的植物不同部位突變表型分類

4 我國EMS 誘變研究進展

論文在很大程度上能直觀反映學術研究的進展，包括在各類期刊發(fā)表的論文和研究生學位論文等。同時，發(fā)明專利也能從一定的側面反映科學研究的進展程度。筆者對1989 年以來國內發(fā)表的EMS 相關的論文和專利進行了統(tǒng)計，如圖1 所示。早期進行EMS研究較少，2000 年之前發(fā)表的相關論文不超過30 篇，學位論文研究基本為空白。進入到2000 年以后，隨著生物技術的迅速發(fā)展，EMS 誘變作為獲取新材料最短平快的方法被廣泛利用，發(fā)表的相關論文數量逐年遞增，學位論文研究也隨之增加。2010 年以后，從事該研究的科研單位與日俱增，論文發(fā)表量顯著上升，其中僅2015 至2019 年期間就有132 篇與之相關的論文發(fā)表，學位論文數量也達到43 篇，專利數量在此期間迅猛增加。從圖上數據可以看出，我國20 世紀80 年代末開始進行EMS 誘變起步研究，直到20 世紀末，這期間只有少數單位從事相關研究。進入21 世紀后，從事EMS 誘變研究的單位不斷增加，論文發(fā)表數目呈直線上升趨勢，研究范圍不斷擴大，研究內容也更加深入。

從文獻研究內容來看，早期的EMS 誘變相關研究主要集中于EMS 誘變條件的改良，誘變對農作物性狀產生的影響，以及誘變材料的初步篩選等方面，之后逐漸過渡到突變體庫的構建，近期的研究則主要傾向于材料篩選后期群體構建、基因定位和遺傳轉化等。目前，研究者已利用EMS誘變技術，成功構建水稻、辣椒、大豆、玉米、冬瓜、西瓜、甜瓜、黃瓜等突變體庫。顧佳清[25]等用EMS 對粳稻品種“中花11”種子進行誘變處理，產生了穗部、籽粒、莖稈、葉片等形態(tài)突變，篩選并鑒定出突變體材料861 份，初步構建了突變體庫。弭寶彬[26]等研究了處理濃度和處理時間對冬瓜種子萌發(fā)和生長的影響，結果表明冬瓜種子最佳誘變條件為1.2%EMS 誘變處理12 h，建立了冬瓜種子EMS 誘變體系，構建了冬瓜突變體庫。有研究員對玉米花粉進行誘變，并構建了TILLING 群體，建立了變異豐富的突變體庫。

圖1 我國EMS 誘變相關論文及專利數據統(tǒng)計情況

5 展 望

EMS 誘變因其操作簡便、突變頻率高、染色體畸變頻率低等優(yōu)勢，被現代育種學研究者廣泛應用，EMS 誘變技術的發(fā)展推動了植物功能基因組學快速發(fā)展，由此誕生了圖位克隆技術和定向誘導基因組局部突變技術，后者將傳統(tǒng)的化學誘變方法和突變體高效篩選有效結合，具有高通量、低成本的特性，從而大大加快了植物基因組學的研究進程[27]。

與其他育種方法一樣，EMS 誘變同樣存在局限性，如隨機性太強、自身突變效率不高、有益突變少等，因此難以實現真正意義上的定向誘變育種。近年來，分子遺傳學研究不斷深入，利用基因工程技術輔助育種成為當前研究的熱點，尤其是 CRISP 技術，能通過RNA 介導的Cas9 酶切作用，在完整基因組上的特定位點完成切割反應，從而實現對基因組進行高效定點修飾[28-30]。誘變育種適用于隱性基因控制的個別性狀改良，若能通過EMS 誘變育種與遺傳工程結合，具有十分廣闊的前景，譬如離體培養(yǎng)結合離體誘變和離體篩選。利用基因重組技術，便有可能直接對DNA 施加誘變處理，獲得離體誘變，實現“定向誘變”。

EMS 誘變可以實現在短期內獲得大量的突變體，構建突變體庫，具有其他誘變育種方式所不具備的優(yōu)點，因此常被現代育種學家用于大規(guī)模突變研究。目前，學科間的相互滲透已成為當前科學發(fā)展的一大趨勢，誘變育種學也必定能揚長避短，在與功能基因組學等相鄰學科的相互滲透中得到更快的發(fā)展。