王豪強，李國玲，黃廣燕，李紫聰，鄭恩琴，徐錚，楊化強,2，吳珍芳,2，張獻偉,2，劉德武

·生物技術(shù)與方法·

CRISPR/Cas13系統(tǒng)敲減HEK293T細胞和基因表達

王豪強1，李國玲1，黃廣燕1，李紫聰1，鄭恩琴1，徐錚1，楊化強1,2，吳珍芳1,2，張獻偉1,2，劉德武1

1 華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院 國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642 2 溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527400

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白 (CRISPR-associated proteins，Cas) 系統(tǒng)是目前基因編輯、基因表達研究的熱點，其中靶向RNA的CRISPR/Cas13系統(tǒng)的開發(fā)為RNA的干擾和編輯提供了新的方向。文中針對HEK293T細胞非同源末端連接 (Nonhomologous end joining，NHEJ) 通路修復(fù)關(guān)鍵因子Ku70和Lig4的編碼序列，設(shè)計并合成CRISPR/Cas13a、b系統(tǒng)相應(yīng)的gRNA，檢測其對和基因表達的影響。結(jié)果顯示，Cas13a對和的RNA敲減效果可以達到50%以上，Cas13b對和的RNA敲減效果分別達到92%和76%；同時Cas13a、b系統(tǒng)能將Ku70和Lig4蛋白水平分別下調(diào)至68%和53%。CRISPR/Cas13系統(tǒng)可有效敲減HEK293T細胞RNA和蛋白質(zhì)表達，為基因功能和調(diào)控研究提供一種新的策略。

CRISPR/Cas13，，，基因敲減

CRISPR/Cas系統(tǒng)是來源于細菌與古菌的一種后天免疫防御系統(tǒng)，主要用于防止外來質(zhì)?；蚴删w的侵入[1]，其中ⅡCRISPR/Cas9系統(tǒng)能對基因組DNA實現(xiàn)精確編輯，目前已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)學領(lǐng)域[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)一種新型的靶向RNA的CRISPR蛋白Cas13，它的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)為人類干擾和編輯RNA提供更便捷的方法。Cas13屬于2類Ⅵ型CIRSPR關(guān)聯(lián)蛋白家族，該蛋白目前共發(fā)現(xiàn)4種亞型，分別是Cas13a (也稱作C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d[3]。與CRISPR/Cas9類似，Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)含有一個效應(yīng)蛋白即Cas13蛋白，它與CRISPR RNA (crRNA) 結(jié)合后形成一個crRNA引導(dǎo)的RNA靶向復(fù)合物[4-7]。截至目前，所發(fā)現(xiàn)的Cas13蛋白均有兩個截然不同的核糖核酸酶活性。其一，主要用于pre-crRNA的加工，有利于Ⅵ型干擾復(fù)合物的形成；其二，由兩個高等真核和原核核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Higher eukarytoes and prokaryotes nucleotide-binding domain，HEPN) 提供，是病毒干擾過程中降解外來RNA的關(guān)鍵。另外，除了Cas13蛋白外，部分Ⅵ型系統(tǒng)擁有額外的附屬蛋白，這些蛋白是非必需的，但具有調(diào)節(jié)干擾效果的活性[5-6]。Ⅳ-B和Ⅵ-C系統(tǒng)缺乏適應(yīng)性基因和，說明它們可能利用同一基因組內(nèi)的其他Cas位點獲取適應(yīng)模塊，或者丟失適應(yīng)模塊，不再需要獲取新的原始間隔序列。特別地，Cas13b存在兩種亞型Ⅵ-B1和Ⅵ-B2，其中Ⅵ-B1系統(tǒng)擁有一個額外的開放閱讀框Csx28，它編碼一種小蛋白，該小蛋白帶著一個假定的跨膜結(jié)構(gòu)域(或信號肽) 和一個發(fā)散的HEPN結(jié)構(gòu)域；Ⅵ-B2系統(tǒng)擁有一個不同的開放閱讀框Csx27，它編碼一種包含3–4個可預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域。Ⅵ-D系統(tǒng)具有更小的Cas13蛋白，并且攜帶一個與原核防御系統(tǒng)有關(guān)的WYL結(jié)構(gòu)域附屬蛋白。張鋒實驗室根據(jù)Cas13蛋白靶向RNA的性質(zhì)，設(shè)計并開發(fā)了靶向RNA的CRISPR/Cas13a、b系統(tǒng)[8]，通過設(shè)計28/30 nt的RNA互補序列，可以實現(xiàn)特異性切割靶RNA和非特異性切割周圍環(huán)境的RNA。研究表明，來源于纖毛菌屬的LwaCas13a具有50%左右的RNA敲減水平[8]，來源于普氏菌屬 (sp. P5-125) 的PspCas13b在螢火蟲素酶報告載體上具有90%–95%的RNA敲減水平[9]。相對傳統(tǒng)的RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 技術(shù)，CRISPR/Cas13系統(tǒng)具有更好的專一性和更低的脫靶效應(yīng)[8-11]；相對于CRISPR/Cas9等DNA編輯工具，RNA水平的編輯避免了任何由于對遺傳基因組DNA操作所引發(fā)的脫靶效應(yīng)的擔憂，為基因編輯器的改造和疾病的治療提供了多種可選擇的高效手段。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾NHEJ關(guān)鍵因子Ku70、Ku80、PNKP、Lig4等可顯著提高豬原代成纖維細胞的同源定向修復(fù) (Homology- directed repair，HDR) 效率[12-13]，同時CRISPR干擾Ku70和Ku80同樣能夠顯著提高HDR編輯效率[14-15]。因此，本研究嘗試利用CRISPR/Cas13a、b系統(tǒng)特異性敲減HEK293T細胞和基因表達，為提高HDR效率提供一種新的策略，為CRISPR/Cas13蛋白的研究提供經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

Cas13a系統(tǒng) (#91906和#91924)、Cas13b系統(tǒng)(#103854和#103862) 和mCherry2-C1質(zhì)粒 (# 54563) 均來源于美國Addgene。HEK293T購自美國標準生物品收藏中心 (#ATCC ACS-4500)。

1.2 Cas13a、b系統(tǒng)構(gòu)建

針對人(GeneID: 2547) 和(GeneID: 3981) 2個基因的CDS序列分別設(shè)計對應(yīng)的gRNA (表1和表2)，并由北京六合華大基因科技有限公司合成gRNA oligo引物。參考Thermo Fisher Scientific的Fast DigestⅠ說明書線性化Cas13a、b的U6質(zhì)粒。將上述合成的引物退火后與線性化的U6質(zhì)粒16 ℃過夜連接，詳細體系見TaKaRa T4 DNA Ligase (#2011A) 說明書。將連接好的環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，并劃線涂板。第2天將擴大培養(yǎng)的單克隆菌落(AmpR) 進行Sanger測序，測序引物為U6 (human): CCGTAACTTGAAAGT ATTTCG，將測序正確的菌液在氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL的LA培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并用Omega bio-tek公司的Endo-Free Plasmid Mini Kit II (#D6950) 進行質(zhì)粒抽提備用，為后續(xù)HEK293T細胞轉(zhuǎn)染做準備。

表1 Cas13a和Cas13b靶向ku70的gRNA序列

表2 Cas13a和Cas13b靶向lig4的gRNA序列

1.3 細胞培養(yǎng)與傳代

將液氮保存的HEK293T在37 ℃水浴鍋中快速解凍，解凍的細胞經(jīng)600×、5 min離心后，使用含10% FBS (Gibco) 和1% Anti-Anti (Invitrogen) 的DMEM (Invitrogen) 生長培養(yǎng)基重懸細胞并進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。細胞生長至90%時，用PBS清洗2遍，隨后加入適量的Trypsin/EDTA (0.05%，Gibco) 消化1–2 min，待細胞完全脫落后用生長培養(yǎng)基終止反應(yīng)，600×離心5 min后，使用生長培養(yǎng)基重懸細胞并接種至新的細胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 實時熒光定量PCR檢測Cas13a、b系統(tǒng)對mRNA的干擾效果

當HEK293T細胞匯合度達到70%–90%時，參考Thermo Fisher Scientific公司的Lipofectamine 3000 Reagent說明書轉(zhuǎn)染細胞。以24孔板為例，每孔將500 ng Cas13a、b質(zhì)粒分別和500 ng 相應(yīng)的U6-gRNA共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，抽提細胞RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后對細胞cDNA進行實時熒光定量PCR，檢測和的RNA表達水平，熒光定量PCR引物見表3。

1.5 Cas13a、b系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率

為了鑒定Cas13a、b系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率，將不同的Cas13a、b系統(tǒng)(包括Cas13質(zhì)粒和U6-gRNA質(zhì)粒) 分別同mCherry2-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細胞，質(zhì)粒用量均為500 ng/孔，步驟與上述保持一致。待細胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用流式細胞術(shù) (BD accuri C6 plus) 檢測紅光細胞比例，通道為FL3。紅光細胞比例間接反映Cas13系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率。

1.6 Western blotting檢測目的基因的蛋白水平

將上述轉(zhuǎn)染48 h的細胞用PBS清洗2遍后，使用碧云天的Western及IP細胞裂解液 (#P0013) 裂解細胞。將5×蛋白緩沖液加入裂解后的樣品中并在100 ℃水中煮沸5–10 min。使用BCA法測定蛋白濃度便于SDS-PAGE上樣。將蛋白總量為20 μg的蛋白樣品上樣至12%的SDS-PAGE凝膠孔中，70 V電泳30 min，90 V電泳1–2 h。使用iBlot 2 Gel Transfer Device系統(tǒng) (Invitrogen) 將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，4 ℃過夜孵育1︰2 000 KU70 (Proteintech, #10723-1- AP) 兔多克隆抗體或1︰2 000 LIG4 (Abcam，#ab193353) 兔單克隆抗體和1︰2 000 β-Actin (Cell signaling，#4970S) 兔單克隆抗體，TBST洗膜3次，TBS洗膜1次后，室溫孵育山羊抗兔IgG 1–2 h，并按上述方法洗膜。將清洗好的膜浸濕并顯色后置于UVP顯色裝置曝光拍照，隨后用ImageJ 1.52a (National Institutes of Health，USA) 軟件進行灰度掃描分析[16-17]，將目的蛋白灰度值參照內(nèi)參灰度值進行歸一化處理3次。使用GraphPad Prism 8.0軟件將歸一化處理的數(shù)據(jù) 作圖。

1.7 統(tǒng)計分析

表3 實時熒光定量PCR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 Cas13a、b系統(tǒng)構(gòu)建

將合成的gRNA退火后與Ⅰ酶切的線性化U6質(zhì)粒進行連接。單克隆菌擴大培養(yǎng)后進行Sanger測序，測序結(jié)果(圖1) 符合預(yù)期。

2.2 Cas13a、b系統(tǒng)對ku70和lig4基因mRNA水平的影響

針對和基因，我們分別為Cas13a系統(tǒng)設(shè)計3對gRNA，Cas13b系統(tǒng)設(shè)計6對gRNA。將Cas13a、b系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48 h后熒光定量PCR顯示，所有Cas13a、b系統(tǒng)的不同gRNA對mRNA的表達水平均呈現(xiàn)出顯著下調(diào)的現(xiàn)象 (<0.01)，其中Cas13a-g2對的敲減效果可以達到56%，Cas13b-g5對的敲減效果高達92% (圖2A)。另外，在對基因的干擾上，僅有Cas13b-g2和g5展現(xiàn)出顯著的敲減效果，分別達到70%和76%的敲減水平 (圖2B)，其余如Cas13a-g3和Cas13b-g4則具有較大的RNA敲減趨勢 (<0.1)。

2.3 Cas13a、b系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率評估

將共轉(zhuǎn)Cas13系統(tǒng)和紅光質(zhì)粒mCherry2-C1的HEK293T細胞用PBS清洗2次，經(jīng)胰酶消化并離心，PBS重懸后，使用流式細胞術(shù)檢測紅光細胞比例。如圖3所示，紅色熒光細胞數(shù)約占總細胞數(shù)的65.7%–71.0%，即3對Cas13a的gRNA和6對Cas13b的gRNA轉(zhuǎn)染效率無明顯差異。

2.4 Cas13a、b系統(tǒng)對Ku70和Lig4蛋白水平的影響

將Cas13a、b系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48 h后裂解并變性，用于Western blotting實驗。使用ImageJ軟件分析，結(jié)果顯示，Cas13a-g2、g3和Cas13b-g2、g4–g6均能將Ku70蛋白表達水平下調(diào)20%以上，其中Cas13a-g3和Cas13b-g2在各自系統(tǒng)中具有最大的下調(diào)能力，分別能夠?qū)u70蛋白表達下調(diào)至74%和68% (圖4A)。此外，除Cas13a-g2外其余gRNA均能使Lig4蛋白水平下調(diào)20%以上，其中Cas13a-g3和Cas13b-g4在各自系統(tǒng)中具有最大的下調(diào)能力，分別能夠?qū)ig4蛋白水平下調(diào)至73%和53% (圖4B)。

圖1 Cas13a、b系統(tǒng)重構(gòu)質(zhì)粒測序

圖2 Cas13a、b對ku70和lig4基因mRNA水平的影響(A: Cas13a、b系統(tǒng)對ku70基因mRNA水平的影響；B: Cas13a、b系統(tǒng)對lig4基因mRNA水平的影響)

圖3 Cas13a、b系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率評估(A: mCherry紅光校正Cas13a、b系統(tǒng)的流式細胞圖；B: Cas13a、b系統(tǒng)干擾ku70的轉(zhuǎn)染效率；C: Cas13a、b系統(tǒng)干擾lig4的轉(zhuǎn)染效率)

圖4 Cas13a、b對Ku70和Lig4蛋白水平的影響(A: Cas13a、b對Ku70蛋白水平的影響；B: Cas13a、b對Lig4蛋白水平的影響)

3 討論

CRIPSPR/Cas13系統(tǒng)是一種新興的有望替代RNA干擾的RNA編輯技術(shù)[8-9]。本研究使用CRISPR/Cas13a、b系統(tǒng)能夠有效降低和的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，但不同的gRNA擁有不同的敲減效果。最近研究表明，哺乳動物細胞中，靶向RNA的低二級結(jié)構(gòu)能夠大大提高轉(zhuǎn)錄本的敲減效果[8]。由于Cas13系統(tǒng)不具備解旋酶活性，RNA的高級結(jié)構(gòu)影響gRNA靶向能力，故而在gRNA設(shè)計時需要考慮RNA的可靶向性以及周圍二級結(jié)構(gòu)對RNA切割能力的影響[18]。人的Ku70和Lig4蛋白分別由和基因編碼，根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫顯示，基因存在8個轉(zhuǎn)錄本，其中6個能夠翻譯形成蛋白，基因具有5個能夠翻譯成蛋白的轉(zhuǎn)錄本，這些差異的轉(zhuǎn)錄本主要是mRNA的前體或由于可變剪切造成的。基于Cas13蛋白的切割原理，本研究將熒光定量PCR引物設(shè)計在靶位點兩端，以便檢測RNA水平的變化，初步了解敲減事件的發(fā)生。由于多轉(zhuǎn)錄本具有相同的靶位點，可能影響目的蛋白的下調(diào)水平，因此我們建議設(shè)計gRNA時盡可能避免可變剪切帶來的影響。另外，部分gRNA使得目的基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達不一致。原因可能如下：1) 基因的表達一般分為轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層面，尤其是真核生物的基因表達存在時間和位置的時空間隔。蛋白表達存在一定的滯后性，48 h可能不足以使得轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平保持一致。而過久的轉(zhuǎn)染時間會導(dǎo)致一定的細胞毒性問題。2) 受可變剪切的影響[19]，可靶向RNA的種類大于1，使得靶向能力分散。另外，多轉(zhuǎn)錄本的存在影響基因表達調(diào)控，進而影響蛋白表達水平。3) 蛋白調(diào)控過程是復(fù)雜的，DNA修復(fù)因子如Ku70、Lig4等存在交互網(wǎng)絡(luò)，而這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全被人類了解。4) Cas13質(zhì)粒大小約13 kb，基因的干擾表達受轉(zhuǎn)染效率的影響較大。5) gRNA靶向特異性影響Cas13系統(tǒng)對mRNA的調(diào)控效率，特異性高、脫靶效率低的gRNA更容易富集在靶位點區(qū)域，具有更快、更強地干擾基因表達的能力。另外，和敲減效果的不同除了gRNA的影響外，Cas13系統(tǒng)不同亞型的切割活性也是影響敲減效果的因素之一。Konermann等發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞中Cas13d具有比Cas13a、b更強烈、更可觀的敲減效果[7]，這個現(xiàn)象可能是由于Cas13d擁有更小的蛋白分子量，能夠更容易地轉(zhuǎn)染或包裝到細胞內(nèi)，并對細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯有著較低的負擔所造成的。

與RNAi相比，盡管Cas13系統(tǒng)未能將轉(zhuǎn)錄水平敲減至1%以下，但其對蛋白的敲減已達到RNAi的水平[12]。另外，CRISPRi和NgAgoi也僅能敲減Ku70和Lig4約40%–60%的蛋白表達 量[14-15]。這些結(jié)果證明Cas13a、b系統(tǒng)成功達到我們的預(yù)期，并具備巨大的潛在價值。目前，CRISPR/Cas13a、b系統(tǒng)對蛋白敲減效果有限，主要在于Cas蛋白分子量巨大，轉(zhuǎn)染或病毒包裝以及細胞內(nèi)蛋白運轉(zhuǎn)困難。因此，Rauch等基于人類蛋白特性設(shè)計并合成了CIRTS系統(tǒng) (CRISPR/Cas inspired RNA targeting system)[20]，整個系統(tǒng)僅有2.7 kb，克服了Cas13系統(tǒng)分子量大和免疫原性的限制。此外，Cas13系統(tǒng)除了靶向RNA，敲減目的RNA的作用外，還可用于RNA編輯，糾正由于基因突變所導(dǎo)致的疾病[9,21]。它不改變基因組序列的特性讓其具有可逆性，似乎在基因治療等方面比CRISPR/Cas9系統(tǒng)更為安全。本研究使用CRISPR/Cas13a、b系統(tǒng)主要針對Ku70和Lig4蛋白，篩選出了具有顯著敲減效果的gRNA。在不編輯基因組的條件下，為基因功能和調(diào)控研究提供一種可行方案。

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Knockdown the expression ofandin HEK293T cells by CRISPR/Cas13 system

Haoqiang Wang1, Guoling Li1, Guangyan Huang1, Zicong Li1, Enqin Zheng1, Zheng Xu1, Huaqiang Yang1, 2, Zhenfang Wu1, 2, Xianwei Zhang1, 2, and Dewu Liu1

1 National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China 2 Wens Foodstuff Group Co., Ltd, Yunfu 527400,Guangdong,China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated proteins (Cas) system is a hotspot of gene editing and gene expression research, in which CRISPR/Cas13 system provides a new direction for RNA interference and editing. In this study, we designed and synthesized the corresponding gRNAs of CRISPR/Cas13a and CRISPR/Cas13b systems in non-homologous end joining (NHEJ) pathway, such as Ku70 and Lig4, and then detected the expression ofandin HEK293T cells. The CRISPR/Cas13a system could efficiently knockdown the mRNA expression ofandmore than 50%, and CRISPR/Cas13b system also suppressedandabout 92% and 76%, respectively. Also, CRISPR/Cas13a, b systems could down-regulate Ku70 and Lig4 proteins level to 68% and 53%, respectively. The study demonstrates that the CRISPR/Cas13 system could effectively knockdown the expression of RNA and protein in HEK293T cells, providing a new strategy for gene function and regulation research.

CRISPR/Cas13,,, gene knockdown

10.13345/j.cjb.190494

November 1, 2019;

February 19, 2020

Supported by: National Transgenic Major Projects (No. 2016ZX08006002), Project of R & D Plan in Key Areas of Guangdong, China (No. 2018B020203002).

Dewu Liu. Tel: +86-20-85284816; E-mail: dwliu@scau.edu.cn

Xianwei Zhang. Tel: +86-766-2986345; E-mail: zxianw@163.com

國家轉(zhuǎn)基因重大專項 (No. 2016ZX08006002)，廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項 (No. 2018B020203002) 資助。

王豪強, 李國玲, 黃廣燕, 等. CRISPR/Cas13系統(tǒng)敲減HEK293T細胞和基因表達. 生物工程學報, 2020, 36(7): 1414–1421.

WangHQ, LiGL, HuangGY, et al. Knockdown the expression ofandin HEK293T cells by CRISPR/Cas13 system. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1414–1421.

(本文責編 郝麗芳)