公菲菲，李 森，杜 崴，高 陽，侯非凡，亢秀萍

（山西農業(yè)大學 園藝學院/山西省設施蔬菜提質增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷 030801）

開花是植物生命過程中的一個重要的發(fā)育過程，其中開花時間是農業(yè)生產上一個重要農藝性狀，適宜的開花時間有利于植物的正常發(fā)育和后代繁衍［1］。植物的開花受內源生物鐘和外源環(huán)境條件的影響。有研究表明，曇花、夜來香、牽牛等植物花瓣的開放主要是受自身24 h 的晝夜生物鐘所控制［2］。在模式植物擬南芥中的基因組功能研究和遺傳學研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)百個基因的表達受到生物鐘的調控［3-4］，在其他物種上生物鐘基因的研究工作僅限于根據(jù)基因的同源性克隆已報道的生物鐘基因，驗證其功能。生物鐘中央振蕩器是植物晝夜節(jié)律的核心系統(tǒng)，擬南芥的生物鐘晝夜節(jié)律的模型中生物鐘核心振蕩器由3 個循環(huán)組成，主要包括中心循環(huán)(Core loop )、早晨循環(huán)(Morning loop )和傍晚循環(huán)(Evening loop )［5］。 中心循環(huán)是最早鑒定參與生物鐘調控的反饋循環(huán)，包括了R1 類Myb 結構域的轉錄因子基因LHY和CCA1，以及一個偽反應調節(jié)蛋白基因Toc1［6-7］。CCA1/LHY可以抑制Toc1的表達，而Toc1可直接或間接的通過一些組分調控CCA1和LHY的表達，以此構成了一個完整的調控循環(huán)［5］。植物就是通過這樣一個多重“轉錄-翻譯反饋循環(huán)網(wǎng)絡”整合環(huán)境信號的變化，維持生物節(jié)律輸出的穩(wěn)定性［8］。在現(xiàn)有的研究中指出LHY與開花時間有關，Yon 等研究表明煙草的NaLHY沉默株系在LD 條件下比對照早2 h 開始開放、在LL 條件下比對照早4 h 開始開放［9］。在金魚草中AmLHY可以提高生長速度并影響著花香的持續(xù)時間和香味分布［10］。

黃花菜是重要的特色蔬菜，且兼具觀賞和藥用價值。由于其花朵只開 1 d 并且天然存在夜間開花和白天開花類群，是花朵開放和閉合研究較好的模式材料。其中，它的開花具有明顯的生物鐘現(xiàn)象，能夠在1 d 中的特定時間整齊開放，夜間開花類群夜開晝閉，采收時間短且比較集中，觀賞價值低。研究者通過調查黃花菜和萱草F1雜種花的開閉時間，可以初步確定花朵開放受一個主基因控制，夜間開花性狀是顯性，白天開花則是隱性性狀，控制花朵開放時間的基因屬于核基因［11-12］。目前，黃花菜生物鐘基因的研究工作尚未開展，本課題組前期在對自然群體開花時間進行關聯(lián)分析時發(fā)現(xiàn)，c33464.graph_c0 與開花時間相關，在轉錄組數(shù)據(jù)庫中的注釋信息顯示其為LHY基因（未發(fā)表）。本試驗以大同黃花（Hemerocallis citrinacv.‘DatongHuanghua’）為材料，克隆黃花菜LHY基因，并對該基因進行生物信息學和時空表達特性分析，為深入研究LHY基因在黃花菜開花過程中的分子機理提供研究基礎，為下一步開展遺傳和外源物質影響開花時間調控黃花菜采收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料大同黃花（Hemerocallis citrinacv.‘Datong- Huanghua’）取自山西農業(yè)大學黃花菜種質資源圃。

本課題組前期觀察發(fā)現(xiàn), 在連續(xù)晴朗的天氣下,大同黃花花蕾通常在17:50—18:10 開口（即花被片和花萼都打開，雌蕊雄蕊同時出現(xiàn)在花被片中間）［13］,在本試驗將開口（18：00）定義為0 h，以0 h 為對照前后每隔6 h 采1 次樣，具體見圖1。另外采集-12 h （6：00）的根、葉、花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊用于分析基因表達的組織特異性。采集樣品后用錫箔紙包裹編號，并置于液氮中速凍，之后置于-80℃ 冷凍保存，每個材料包含3 次生物學重復。

圖1 不同時期黃花菜樣品Fig.1 Sample of Hemerocallis citrina cv. ‘DatongHuanghua’in different stages

1.2 總RNA 提取及cDNA 合成

使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 試劑盒，根據(jù)說明書Protocol-II 多糖多酚植物組織的裂解步驟提取Total RNA，參考侯非凡［14］的方法用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀鑒定RNA 質量和濃度, 用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進行反轉錄合成cDNA。

1.3 基因的克隆

在大同黃花（Hemerocallis citrinacv.‘Datong Huanghua’）轉錄組測序數(shù)據(jù)庫測序結果中查找c33464.graph_c0 的Unigene 序列，通過ORF-Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 找到其ORF 序列［15］，使用Snapgene 在UTR 區(qū)域設計特異性引物c33464-F/R，以黃花菜-12 h（6：00）樣品的cDNA 作為模板，使用2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix ( 聚合美公司) 進行基因cDNA序列的擴增，PCR 程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR 產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段連接19-T 載體（TAKARA 公司）， 用M13-F/R 引物進行測序。用 DNAMAN7.0 將克隆得到的序列與轉錄本c33464.graph_c0 進行比對，并與黃花菜基因組（未公布）對應的Scaffold 進行比對；然后在 NCBI 網(wǎng)站上進行序列比對，定義所克隆的基因。通過Gene Structure Display Server(GSDS, http://gsds.cbi.pku.edu.cn) 預測HcLHY基因的結構信息［16］。

表 1 HcLHY 基因克隆引物和qRT-PCR 引物表Table 1 Cloning primers and qRT-PCR primers of HcLHY

1.4 生物信息學分析

用NCBI-CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白保守結構域預測［17］，并在 NCBI-blastp 進行同源性比對，使用 MEGA5.0 構建蛋白進化樹，采用NJ 法 ( Neighbor Joining Method ) 構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap 值由 1 000 次重復得到［18］。

使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對LHY 蛋白的基本理化性質進行分析；Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）可對蛋白親疏水性進行分析，通過在線分析工具 TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 對候選基因進行跨膜結構域分析; 通過在線分析工具 PSORT Prediction（http://psort1.hgc.jp/form.html）可對候選基因進行亞細胞定位預測分析；通過在線分析工具 SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對候選基因進行信號肽分析［19］。

1.5 時空表達特異性分析

本試驗以黃花菜各樣品的Total RNA 反轉錄所得的cDNA 為模板進行qRT-PCR 擴增，引物為 q33464-F/R，不同發(fā)育時期的內參基因使用AP4-F/R， 不同組織使用的內參基因為Act-F/R［20］。參照TAKARA 公司TB Green? Premix ExTaq? II(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進行擴增，反應體系為20 μL：TB Green Premix ExTaqII 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，10 μmol/L q33464-F/R各0.8 μL，ddH2O 7 μL，100 ng/μL 模 板cDNA 1 μL；反應程序為：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火延伸30 s，40 次循環(huán)。進行RT-qPCR 反應時，每個樣品設置3 次生物學重復3 次技術重復，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。使用SPSS 軟件以Duncan’s 法進單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著水平，P＜0.01 為差異極顯著水平，GraphPad Prism 7 繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 HcLHY 的cDNA 克隆

以黃花菜開口前-12 h（6:00）樣品的cDNA為模板，以c33464-F/R 為引物，克隆HcLHY基因的cDNA 全長共計2 126 bp。經(jīng)NCBI-ORF Finder 分析，得到HcLHY基因 ORF 區(qū)，片段長1 929 bp，編碼642 個氨基酸。此外，將克隆到的序列在黃花菜基因組（未公布）中Blast 得到mergeScaf19802，經(jīng)序列比對后顯示克隆序列、轉錄本（c33464.graph_c0）對應的CDS 和基因組外顯子的一致性為100%。通過NCBI-blastp 進行序列比對，HcLHY與AoLHY(XP_020245416.1)、EgLHY(XP_010934912.2)、PdLHY(XP_008788724.1) 編碼的蛋白同源性比較高，擁有相同保守域，并將本基因命名為HcLHY基因。由NCBI-CD Search 預測其保守結構域可知，在蛋白序列的N-羧基端有一預測其基因結構顯示有5 個外顯子，4 個內含子。個Myb DNA-binding 保守結構域，位于氨基酸序列的24 ～69 位點，并且具有蛋白相互作用模塊功能的SANT 結構域，由此可知HcLHY 是一個典型的 MYB 轉錄因子。通過Gene Structure Display Server

圖2 HcLHY 基因的序列分析Fig.2 Sequence analysis of HcLHY

2.2 HcLHY 的生物信息學分析

利用 ProtParam 軟件對HcLHY基因編碼氨基酸進行基本理化性質預測(表 1)，HcLHY 蛋白屬不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)(Instability index II)為53.88（大于40），相對分子量為69 470.67 D，理論等電點(pI)為 5.82。80 個帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu），占總氨基酸的12.5%；71 個帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)，占總氨基酸的11.1%。340 位的Ala 丙氨酸和341 位的Thr（谷氨酸疏水性最強的（2.356），476 位的甘氨酸Glu、477 位的Gln、478 位的Asn 和479 位的Glu 親水性最強（-3.544）。總平均親水性（GRAVX）為-0.626 1，預測為親水蛋白。預測HcLHY基因編碼蛋白不具有跨膜結構域; 為轉錄因子，定位于細胞核中; 不具備信號肽。

表2 HcLHY 蛋白氨基酸殘基組成Table 2 Composition of amino acid residues in HcLHY protein sequence

圖3 HcLHY 蛋白分析Fig.3 Analysis of HcLHY protein

2.3 HcLHY 蛋白同源性比對及進化樹分析

將HcLHY基因編碼的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Protein Blast 比對，發(fā)現(xiàn)其與蘆筍（Asparagus officinalis）、玉米（Zea mays）、海棗（Phoenix dactylifera）、野芭蕉（Musa acuminata subsp. malaccensis）、油棕（Elaeis guineensis）等有較高的同源性分別為53.49%、39.41%、43.89%、41.43%、44.81%，上述植物均為單子葉植物。和模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana(AT1G01060 )的相似性為37.47%。利用MEGA5.0 將HcLHY 蛋白與其他物種進行多序列比對（圖4），結果顯示，HcLHY 蛋白與其他物種LHY 同源蛋白相比，在羧基端有共同的保守區(qū)域，這可能與MYB 轉錄因子的功能域存在于序列的羧基端有關。

使用MEGA5.0 構建系統(tǒng)進化樹，分析HcLHY蛋白與其他物種LHY 同源蛋白的進化關系，結果如圖5 所示，HcLHY 與同為百合科的蘆筍蛋白聚在一支，親緣關系最近，與非洲油棕、海棗親緣關系較近。

圖4 HcLHY 蛋白序列比較及保守結構域motifFig.4 HcLHY protein sequence comparison and conserved domain motif

圖5 LHY 蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of LHY

2.4 HcLHY 基因的時空表達特異性分析

為了探究HcLHY基因在花開放進程中的表達量，對HcLHY基因進行了時空特異性分析（圖6、圖7）。在開放前-12 h（6：00）表達量達到最大，從圖6 可以看出+12 h（6：00）花朵已閉合，此時表達量降低。

圖6 HcLHY 基因的表達分析Fig.6 HcLHY gene expression analysis

組織特異性分析結果顯示(圖7)，HcLHY基因在花蕾開口前-12 h（6:00）不同組織中表達量存在差異，在花瓣中表達量最高，顯著高于葉片、雌蕊、雄蕊、花萼及根，根中表達量最低。

圖7 HcLHY 基因的表達分析Fig.7 HcLHY gene expression analysis

3 結論與討論

LHY基因是在擬南芥中最先分離出來的，研究發(fā)現(xiàn)，LHY基因是一個典型的 R1 類 MYB 轉錄因子，是生物鐘核心振蕩器的關鍵基因之一［21］。LHY基因的表達具有晝夜節(jié)律性，其表達除了受光照和溫度等環(huán)境信號的影響外，同時也受生物鐘內源機制的調節(jié)。本試驗中首次從萱草屬植物中克隆得到生物鐘基因HcLHY，并對其結構特征及花開放過程中的表達特性做了初步分析。該基因所編碼蛋白具有典型的Myb DNA-binding 保守結構域，同源性分析顯示黃花菜HcLHY編碼的氨基酸序列與其他物種LHY 具有較高的相似性，且在N 端有共同的保守結構域，進化分析發(fā)現(xiàn)相同科或類群的植物聚為一類，HcLHY 與蘆筍親緣關系最近，同時發(fā)現(xiàn)不同植物的LHY 蛋白保守結構域也有較高的相似性，在被子植物生物鐘系統(tǒng)中的功能高度保守。

在擬南芥生物鐘模型中，光信號可以激活核心振蕩器基因的表達，然后生物鐘下游基因接收振蕩信號后開始發(fā)揮作用使生物體做出一系列生理生化反應［5］。核心振蕩器中LHY/CCA1基因在黎明時分表達量達到最高峰，同時抑制Toc1基因的表達，而Toc1基因在傍晚達到表達高峰，在此時LHY及CCA1的表達量也因為其抑制作用而降到谷底［22］。在擬南芥、大豆、大白菜［23］、金魚草［10］、朵麗蝶蘭［24］、楊樹［25］等物種上LHY基因都是在黎明出現(xiàn)高峰，傍晚表達量有一個低谷，但他們的檢測的都是該物種葉片24 h 內的表達，本研究以黃花菜為材料首次在花器官上驗證LHY基因24 h 內的表達。在本試驗中LHY基因1 天內的表達量也是在黎明時隨著光照增強達到最高峰，在傍晚最低，有明顯的節(jié)律趨勢，與前人研究結果一致。

此外，在組織特異性的方面，研究者在采集了擬南芥黎明后1 h 的不同組織發(fā)現(xiàn)，葉片和莖的表達量高于根、花序和角果［26］。在朵麗蝶蘭中營養(yǎng)器官的表達量明顯高于生殖器官，表現(xiàn)出莖＞花梗＞蕊柱＞唇瓣＞葉片＞萼片＞花瓣＞根的趨勢［24］。在本研究中采集的是黃花菜黎明6：00 的各組織樣品，花瓣表達量最高，其次是葉片，都顯著高于雌蕊、雄蕊、花萼及根。此外，在‘大同黃花’以根、花蕾、葉片為材料轉錄組數(shù)據(jù)庫中，c33464.graph_c0 花蕾的表達量明顯大于葉片和根，與本研究結果相吻合。由此推測在開花過程中，LHY基因在黃花菜的花器官中發(fā)揮重要作用，花器官感受光信號，引起核心振蕩器節(jié)律性表達，然后生物鐘下游基因接收振蕩信號后開始發(fā)揮作用促使其開花。

LHY基因為生物鐘關鍵基因，在生物鐘調控中起著關鍵作用。在擬南芥中有關生物鐘相關的基因研究的較為透徹，但目前在萱草屬植物中相關基因還未涉及。萱草屬植物具有明顯的24 h 節(jié)律，而開花時間對于萱草屬植物的觀賞時間具有重要影響，同時也直接決定以花蕾為食用器官的黃花菜的采收時間，進而影響黃花菜的產量、品質等重要性狀。本研究通過對黃花菜生物鐘LHY 基因的表達研究，為解析黃花菜LHY基因在開花時間的生物學功能提供了研究基礎，對于挖掘黃花菜植物生物鐘基因的調控網(wǎng)絡，為下一步開展遺傳和外源物質影響開花時間調控黃花菜采收提供理論依據(jù)。