張博欽,尤雅,成池芳,段長(zhǎng)青,燕國(guó)梁*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研發(fā)中心，北京，100083)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100083)3(新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 昌吉，832200)

冷浸漬(cold maceration, CM)是紅葡萄酒釀造中一種常用的工藝，它是指將葡萄除梗破碎后，置于發(fā)酵罐中進(jìn)行一定時(shí)間的低溫浸漬(5～15 ℃)，然后再啟動(dòng)酒精發(fā)酵[1-2]。冷浸漬工藝可以有效浸提葡萄漿果中的香氣化合物(包括香氣前體物質(zhì))和多酚化合物，增加顏色穩(wěn)定性，使葡萄酒的香氣更加濃郁和復(fù)雜[3-4]。在冷浸漬過(guò)程中，低溫抑制了大部分微生物的活動(dòng)，但有研究發(fā)現(xiàn)，在該過(guò)程中仍有部分非釀酒酵母依舊能夠生長(zhǎng)代謝，并對(duì)最終葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)產(chǎn)生積極貢獻(xiàn)。HALL 等[5]在冷浸漬階段分離出多種非釀酒酵母菌株，包括美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)、耐熱克魯維酵母(Kluyveromycethermotolerans)等，進(jìn)一步研究表明這些菌株的存在會(huì)顯著改變酒精發(fā)酵后黑比諾(Pinotnoir)葡萄酒的香氣品質(zhì)，特別是能夠增加一些酯類、高級(jí)醇和萜烯類化合物的含量。為了進(jìn)一步提升非釀酒酵母在冷浸漬工藝中的作用，BENUCCI等[6]在桑嬌維賽(Sangiovese)葡萄冷浸漬階段接入美極梅奇酵母(MetschnikowiapulcherrimaMP346和MetschnikowiafructicolaMF98-3)，發(fā)現(xiàn)萜烯類、酯類，乳酸異戊酯和琥珀酸異戊酯的含量升高，提高了葡萄酒的香氣品質(zhì)。

非釀酒酵母種類眾多，主要包括假絲酵母(Candida)、畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hanseniaspora)、有孢圓酵母(Torulaspora)、梅奇酵母(Metschnikowia)、克魯維酵母(Kluyveromyces)等[7]。大量的研究表明,非釀酒酵母具有一些優(yōu)良釀造特性，如高產(chǎn)香氣化合物(酯類、苯乙醇等)、高產(chǎn)增香酶類(酯酶、β-糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶等)、低產(chǎn)乙酸、改善葡萄酒顏色和口感等[7-10]。其中，戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)是葡萄酒釀造中一種常用的非釀酒酵母，能夠有效提高酯類香氣成分和甘油的合成水平，同時(shí)降低乙酸含量[11-13]。需要指出的是目前非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵中，非釀酒酵母主要是在酒精發(fā)酵階段接入，對(duì)于冷浸漬階段接入非釀酒酵母對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響的研究還非常少，而對(duì)于戴爾有孢圓酵母與冷浸漬工藝相結(jié)合的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室從新疆產(chǎn)區(qū)篩選到1株釀造特性優(yōu)良的野生戴爾有孢圓酵母CVE-Td3，該菌株高產(chǎn)脂肪酸酯類香氣且能夠在較低溫度下生長(zhǎng)。為了提升干紅葡萄酒的品質(zhì)，本研究將冷浸漬工藝與接種戴爾有孢圓酵母相結(jié)合，探究在赤霞珠葡萄冷浸漬階段接種不同濃度的CVE-Td3酵母對(duì)紅葡萄酒香氣品質(zhì)及生物胺含量的影響，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)安全的葡萄酒提供實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

釀酒葡萄：赤霞珠葡萄采自河北廊坊，還原糖質(zhì)量濃度為223 g/L，pH值為3.14，可滴定酸總量為5.22 g/L。

供試酵母：戴爾有孢圓酵母CVE-Td3(以下簡(jiǎn)稱Td3酵母)，篩選自新疆瑪納斯產(chǎn)區(qū)赤霞珠紅葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒研究中心[14]；釀酒酵母EC1118，購(gòu)于法國(guó)Lallemand公司。

1.2 試劑

葡萄糖、果糖、硼酸、硼砂、無(wú)水乙酸鈉、濃硫酸、甘油、無(wú)水乙醇，北京化學(xué)試劑公司；疊氮化鈉，生工生物工程(上海)有限公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品、乙氧亞甲基丙二酸二乙酯(diethyl ethoxymethylene malonate，DEEMM)，美國(guó) Singma-Aldrich 公司；蛋白胨、酵母浸粉和瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇、正己烷(色譜級(jí)，99.9%)，美國(guó)Tedia公司；WL固體培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；賴氨酸固體培養(yǎng)基，OXOID公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DL-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6890氣相色譜儀、Agilent 5975B質(zhì)譜儀、PDMS/CAR/DVB聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯萃取頭、ZORBAX SB-C18色譜柱，美國(guó)安捷倫科技有限公司；新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(T6)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HPX-87H色譜柱，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)使用10 L玻璃發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐使用前均用0.1 mol/L的NaOH稀溶液清洗干凈。將赤霞珠葡萄除梗破碎后添加至發(fā)酵罐容量的80%，然后加入30 mg/L的果膠酶和30 mg/L的SO2。在冷浸漬開(kāi)始階段分別接種不同的濃度的Td3酵母，包括0 CFU/mL(NTd),1×106CFU/mL(LTd)和1×107CFU/mL(HTd)，之后在10 ℃下冷浸漬4 d。冷浸漬結(jié)束后，接入1×106CFU/mL的釀酒酵母EC1118，在(23±2) ℃進(jìn)行酒精發(fā)酵。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)重復(fù)，共6個(gè)發(fā)酵罐。

酒精發(fā)酵期間，每天壓帽2～3次，保證皮渣充分浸漬，發(fā)酵過(guò)程中每天測(cè)定發(fā)酵汁的比重和溫度。酒精發(fā)酵結(jié)束后(還原糖質(zhì)量濃度<4 g/L)，將皮渣過(guò)濾，靜置2 d后轉(zhuǎn)入10 L玻璃發(fā)酵罐中，接入商業(yè)乳酸菌(Viniflora?Oenos, 丹麥科漢森公司)進(jìn)行蘋乳發(fā)酵。當(dāng)蘋果酸消耗完畢時(shí)，結(jié)束蘋乳發(fā)酵。在冷浸漬(NTd-CM、 LTd-CM、 HTd-CM)，酒精發(fā)酵(NTd-AF、 LTd-AF、 HTd-AF)和蘋乳發(fā)酵(NTd-MF、 LTd-MF、HTd-MF)后分別取樣，并將樣品放置于-20 ℃冷藏備用。

1.4.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[15]：在冷浸漬及酒精發(fā)酵過(guò)程中，每隔24 h取樣1次測(cè)定各酵母菌的生長(zhǎng)情況。每次取樣后，使用無(wú)菌水將樣品進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的樣品涂布于WL固體培養(yǎng)基和賴氨酸固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)時(shí)間和菌落數(shù)量繪制不同酵母菌的生長(zhǎng)曲線。

1.4.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

主要代謝產(chǎn)物測(cè)定[3]：使用Agilent 1200高效液相色譜儀進(jìn)行主發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定，離子交換色譜柱為HPX-87H (300 mm×7.8 mm)。其中，葡萄糖、果糖、甘油、乙醇的測(cè)定使用示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫45 ℃，分析時(shí)間30 min；有機(jī)酸(酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸)的測(cè)定采用紫外分光檢測(cè)器，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫60 ℃，分析時(shí)間30 min。每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行測(cè)定。

生物胺的測(cè)定[4]：使用Agilent 1200高效液相色譜儀進(jìn)行生物胺的測(cè)定，色譜柱為ZORBOX SB-C18(50 mm×3.0 mm)。使用示差折光檢測(cè)器，柱溫16 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，分析時(shí)間25 min。每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行測(cè)定。

香氣化合物的測(cè)定[16]：使用Agilent 6890氣相色譜儀和Agilent 5975B質(zhì)譜儀和進(jìn)行香氣物質(zhì)的測(cè)定。載氣為高純氦氣(純度 99.999%)，流速1 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣。使用聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯(PDMS/CAR/DVB)萃取頭和ZORBAX SB-C18色譜柱。柱溫箱升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min。質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為電子轟擊離子化(electron ionization，EI)，離子源能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為29～350m/z。每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行測(cè)定。

香氣成分的氣味活度值(odor activity value，OAV)的計(jì)算[17]，如公式(1)所示：

(1)

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0進(jìn)行差異顯著性分析(analysis of variance，ANOVA)，最低顯著性水平P<0.05。采用Origin 9.0和SIMCA14.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母生長(zhǎng)及主發(fā)酵產(chǎn)物

處理組(LTd和HTd)在冷浸漬及酒精發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)曲線如圖1所示，為了方便比較，我們將對(duì)照組(NTd)中酵母的生長(zhǎng)曲線同時(shí)列出。各實(shí)驗(yàn)組在第9天均能夠順利完成酒精發(fā)酵。在LTd實(shí)驗(yàn)組中(圖1-A)，Td3酵母在第4天達(dá)到最大的生物量(1.52×108CFU/mL)，當(dāng)接入EC1118酵母后，Td3酵母的生物量開(kāi)始迅速下降，這是因?yàn)椴粩嗌叩囊掖紳舛纫约?種酵母間的相互作用所致[18]。在HTd實(shí)驗(yàn)組中(圖1-B)，Td3酵母的生物量在第1天便達(dá)到了2.31×108CFU/mL，之后略有升高，在第4天達(dá)到最大值(2.8×108CFU/mL)。隨著EC1118酵母的加入，Td3酵母的生物量開(kāi)始緩慢下降，這與LTd實(shí)驗(yàn)組有明顯差異。在對(duì)照組NTd中，EC1118酵母的生長(zhǎng)趨勢(shì)與添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd和HTd)相似，其生物量在第8天達(dá)到最大(1.72×108CFU/mL)。但在相同的發(fā)酵時(shí)間下，未添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(NTd)中EC1118酵母的生物量要明顯高于接種Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd和HTd)，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期接種Td3酵母會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸和維生素)，限制了釀酒酵母的生長(zhǎng)[19]。

A-實(shí)驗(yàn)組NTd和LTd；B-實(shí)驗(yàn)組NTd和HTd圖1 發(fā)酵過(guò)程中不同酵母菌濃度的變化趨勢(shì)Fig.1 Yeasts proliferation during fermentation at different trails

各實(shí)驗(yàn)組中主發(fā)酵產(chǎn)物的含量如表1所示，酒精發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組中葡萄糖和果糖含量差異不大。接種Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd-AF和HTd-AF)中甘油和乙醇的含量要明顯低于未添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(NTd-AF)，其中HTd-AF中甘油和乙醇的含量最低(7.23 g/L和11.84%vol)，與對(duì)照組NTd-AF相比分別降低了12.26%和5.20%。同樣，添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd-AF和HTd-AF)中檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和乙酸的含量也明顯低于未添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(NTd-AF)。乙酸會(huì)為葡萄酒帶來(lái)酸腐味，質(zhì)量濃度過(guò)高對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不良影響[13]。LTd-AF和HTd-AF實(shí)驗(yàn)組中乙酸的質(zhì)量濃度與對(duì)照相比降低了30.51%～33.90%，這是戴爾有孢圓酵母區(qū)別于其他非釀酒酵母的明顯特征[12]，能夠提升葡萄酒的感官品質(zhì)。蘋乳發(fā)酵后，HTd-MF實(shí)驗(yàn)組中甘油質(zhì)量濃度和乙醇的含量依舊最低(7.59 g/L和12.40%vol)，與NTd-MF差異依舊顯著，分別降低了4.29%和8.08%。乳酸的含量顯著提升，增幅為141.76%～293.90%，而接種Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd-MF和HTd-MF)中乳酸的含量(質(zhì)量濃度)明顯高于未添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(NTd-MF)，其中HTd-MF中乳酸含量(質(zhì)量濃度)最高(3.23 g/L)。

表1 酒精及蘋乳發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組中主發(fā)酵產(chǎn)物的含量Table 1 The concentrations of main products in trails after alcoholic and malolactic fermentation

2.2 揮發(fā)性香氣物質(zhì)

本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid phase microextration combined with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)法測(cè)定了冷浸漬、酒精發(fā)酵、蘋乳發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組中揮發(fā)性香氣成分的含量，結(jié)果如表2所示。本實(shí)驗(yàn)樣品中共檢測(cè)到42種香氣化合物，主要包括高級(jí)醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、揮發(fā)酸類物質(zhì)和萜烯類物質(zhì)，各物質(zhì)的香氣閾值參考相關(guān)文獻(xiàn)[3, 20]。

表2 冷浸漬，酒精發(fā)酵及蘋乳發(fā)酵后香氣成分的含量 單位：μg/L

2.2.1 酯類

酯類物質(zhì)能為葡萄酒提供令人愉悅的花香和果香，是葡萄酒香氣的重要組成部分[21]。冷浸漬結(jié)束后，酯類物質(zhì)總量(質(zhì)量濃度)由低到高分別為HTd-CM(34 099.57 μg/L)、LTd-CM(40 560.13 μg/L)、NTd-CM(83 549.32 μg/L)。其中，共有7種酯類化合物的OAV值超過(guò)0.1，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸乙酯，這些物質(zhì)能夠?yàn)槠咸丫铺峁┫憬?、草莓、蘋果等水果的香氣以及花香[22-23]。添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd-CM和HTd-CM)中丁酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯的含量均高于未添加Td3酵母實(shí)驗(yàn)組NTd-CM，但只有丁酸乙酯的含量在各實(shí)驗(yàn)組中差異顯著。

酒精發(fā)酵結(jié)束后，大部分酯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度明顯升高，酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度由低到高分別為HTd-AF(127 067.75 μg/L)、LTd-AF(138 202.67 μg/L)、NTd-AF(196 358.95 μg/L)。前人結(jié)果表明，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵能產(chǎn)生更多的酯類物質(zhì)(如乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯)，給葡萄酒貢獻(xiàn)新鮮的水果香氣[24-25]。在本研究中，丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸異戊酯的含量在接種高濃度Td3實(shí)驗(yàn)組(HTd-AF)中最高，與NTd-AF差異顯著，分別提升了274.96%、21.43%、47.37%、34.37%和35.10%。NTd-AF中則含有大量的乙酸乙酯，該香氣物質(zhì)是葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，但其質(zhì)量濃度在高于150 mg/L時(shí)會(huì)增加葡萄酒中的溶劑味等不良味感，對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[10]。NTd-AF中乙酸乙酯質(zhì)量濃度已達(dá)到188.94 mg/L，會(huì)對(duì)葡萄酒的品質(zhì)帶來(lái)一定的消極作用，而HTd-AF和LTd-AF中乙酸乙酯的質(zhì)量濃度為30.51～37.12 mg/L，能夠增加葡萄酒的果香和復(fù)雜性。

蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，各實(shí)驗(yàn)組中酯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生進(jìn)一步的變化。丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸乙酯的質(zhì)量濃度均升高，而辛酸乙酯的含量卻有所下降，這與我們之前的研究結(jié)果一致[15]。其中，癸酸乙酯和辛酸乙酯的變化最為明顯，癸酸乙酯經(jīng)過(guò)蘋乳發(fā)酵后提高了8.89%(NTd)、57.73%(LTd)，而辛酸乙酯則降低了21.90%(NTd)、37.64%(HTd)。酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度由低到高分別為HTd-MF(134 175.77 μg/L)、LTd-MF(155 787.33 μg/L)、NTd-MF(224 534.18 μg/L)。其中HTd-MF含有最高質(zhì)量濃度的丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸異戊酯，與NTd-MF相比差異已經(jīng)顯著，分別提升了53.09%、17.66%、75.16%和28.75%。以上結(jié)果表明，在冷浸漬階段添加Td3酵母后能夠提升葡萄酒中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸異戊酯的含量(質(zhì)量濃度)。

2.2.2 高級(jí)醇

醇類主要是酵母代謝產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物，通常具有刺激性氣味。當(dāng)葡萄酒中的高級(jí)醇含量(質(zhì)量濃度)低于300 mg/L時(shí)，對(duì)葡萄酒香氣具有積極貢獻(xiàn)，可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性。但當(dāng)其總量(質(zhì)量濃度)超過(guò)400 mg/L時(shí)，會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的氣味，導(dǎo)致感官葡萄酒品質(zhì)下降[26]。冷浸漬后，各實(shí)驗(yàn)組的高級(jí)醇含量由低到高分別為NTd-CM(10 644.74 μg/L)、LTd-CM(15 519.50 μg/L)、HTd-CM(20 186.21 μg/L)，均低于300 mg/L。其中1-己醇、反式-3-己烯醇、1-庚醇、異戊醇、苯乙醇和1-辛烯-3-醇的OAV超過(guò)0.1，能夠?yàn)槠咸丫铺峁┲参镂?、油脂味、溶劑味及一定的花香和甜香[22-23,27-28]。

酒精發(fā)酵結(jié)束后，各實(shí)驗(yàn)組的高級(jí)醇總量由低到高分別為HTd-AF(185 508.97 μg/L)、NTd-AF(228 228.35 μg/L)、LTd-AF(285 185.13 μg/L)，其中1-己醇、順式-3-己烯醇、1-庚醇、異戊醇，苯乙醇，1-辛烯-3-醇和2, 3-丁二醇的OAV超過(guò)0.1。與NTd-AF相比，LTd-AF 和HTd-AF能夠顯著增加1-己醇、異戊醇、苯乙醇的含量。苯乙醇是葡萄酒中一種重要的醇類香氣化合物，可為葡萄酒提供玫瑰、蜂蜜等令人愉悅的香氣[17]，其含量在HTd-AF中最高(35.86 mg/L)，是NTd-AF的1.46倍。AZZOLINI等[24]使用戴爾有孢圓酵母發(fā)酵索阿維(Soave)和霞多麗(Chardonnay)葡萄汁能夠使苯乙醇的含量大幅提升，增加葡萄酒中花香和甜香。2,3-丁二醇能夠?yàn)槠咸丫茙?lái)一定的奶油味和果香，豐富葡萄酒的香氣和口感[29]。LTd-AF具有最高質(zhì)量濃度的2,3-丁二醇(159.66 mg/L)，是NTd-AF的1.41倍。

蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，高級(jí)醇的含量進(jìn)一步發(fā)生變化。其中，苯乙醇的含量變化最為明顯，其含量增加了22.87%(LTd)～48.64%(NTd)。各實(shí)驗(yàn)組的高級(jí)醇總量由低到高分別為HTd-MF(280 297.05 μg/L)、NTd-MF(309 096.00 μg/L)、LTd-MF(365 850.10 μg/L)。其中HTd-MF中含有最多含量的1-己醇和苯乙醇，與NTd-MF差異顯著，分別提升了15.83%和39.65%。

2.2.3 其他香氣物質(zhì)

揮發(fā)酸能夠提高葡萄酒香氣的復(fù)雜性，是葡萄酒中重要的一類香氣物質(zhì)[10]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到4種揮發(fā)酸，分別為己酸、辛酸、癸酸和異丁酸，其OAV均超過(guò)0.1。冷浸漬結(jié)束后，HTd-CM中己酸、辛酸、癸酸和異丁酸的含量最高，其揮發(fā)酸總量達(dá)到2 268.47 μg/L。酒精發(fā)酵結(jié)束后，各揮發(fā)酸的含量均有所增加。其中，NTd-AF具有較高質(zhì)量濃度的癸酸(499.31 μg/L)；LTd-AF中己酸(893.92 μg/L)和辛酸(720.50 μg/L)的質(zhì)量濃度最高；HTd-AF則具有較多的異丁酸(1 379.07 μg/L)。蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，己酸和辛酸的含量明顯升高，增加量分別為24.10%(LTd)～54.73%(HTd)和16.65%(LTd-MF)～29.15%(HTd-MF)。HTd-MF中揮發(fā)酸質(zhì)量濃度為最高(3 973.11 μg/L)，為NTd-MF的1.07 倍。除此之外，本研究還檢測(cè)到4種萜烯類化合物，包括傘花烴、萜烯醇、香茅醇和β-大馬士酮。其中，香茅醇和β-大馬士酮OAV超過(guò)0.1，能夠?yàn)槠咸丫铺峁┮欢ǖ拿倒寤ㄏ愫吞鹣鉡17,29-30]。冷浸漬后，HTd-CM具有較高質(zhì)量濃度的β-大馬士酮，經(jīng)過(guò)酒精及蘋乳發(fā)酵后，其質(zhì)量濃度有所下降，但HTd中β-大馬士酮的質(zhì)量濃度始終比其他2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(NTd和LTd)高。

綜上所述，對(duì)比冷浸漬、酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組的香氣物質(zhì)含量，在冷浸漬階段添加Td3酵母能夠增加葡萄酒中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和苯乙醇的質(zhì)量濃度，增加葡萄酒的果香和花香的濃郁程度，改善最終葡萄酒的香氣品質(zhì)，其中在冷浸漬階段添加1×107CFU/mL Td3酵母(HTd)的效果更佳。

續(xù)表2

2.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的主成分分析

為了直觀展示各實(shí)驗(yàn)組之間的差異，我們將OAV>0.1的22種香氣成分進(jìn)行主成分分析(principle compounds analysis，PCA)。由圖2可知，2個(gè)主成分(PC1和PC2)的總貢獻(xiàn)率為88.1%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為76.9%，PC2的貢獻(xiàn)率為11.2%。冷浸漬后，HTd-CM位于第2象限，與NTd-CM和LTd-CM差異明顯。其中，HTd-CM與1-己醇、反式-3-己烯醇和β-大馬士酮密切相關(guān)。酒精發(fā)酵后，HTd-AF位于第1象限，而NTd-CM和LTd-CM位于第4象限，之間的差異依舊明顯。而蘋乳發(fā)酵后，NTd-MF、LTd- MF和HTd- MF均位于第1象限，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差異有所降低。通過(guò)對(duì)冷浸漬、酒精發(fā)酵后和蘋乳發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組的PCA分析，我們發(fā)現(xiàn)，HTd實(shí)驗(yàn)組與其他2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(LTd和NTd)差異明顯，這說(shuō)明冷浸漬階段接1×107CFU/mL的Td3酵母(HTd)能夠改變葡萄酒香氣輪廓，提升葡萄酒香氣的復(fù)雜性和多樣性。

2.4 生物胺

生物胺(biogenic amines)是一類具有生物活性的含氮低分子量有機(jī)化合物的總稱[31]。長(zhǎng)期食用含生物胺的食品，會(huì)引起很多不良反應(yīng)，如頭痛、呼吸紊亂、心悸等[32]。目前，已經(jīng)有許多國(guó)家對(duì)葡萄酒中組胺的最大限量值作出了規(guī)定，如法國(guó)是8 mg/L，而瑞士、匈牙利和奧地利是10 mg/L[33]，而我國(guó)葡萄酒中生物胺的限量值還沒(méi)有明確規(guī)定。已有研究表明，通過(guò)非釀酒酵母能夠降低葡萄酒中生物胺的含量，如MEDINA等[34]在霞多麗葡萄發(fā)酵中接入葡萄園有孢漢遜酵母 02/5A，能夠降低組胺和酪胺的含量。為了明確在冷浸漬中接種戴爾有孢圓酵母Td3對(duì)干紅葡萄酒中生物胺含量的影響，本文對(duì)冷浸漬、酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組中生物胺的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

a-組胺；b-酪胺；c-尸胺；d-腐胺；e-亞精胺；f-精胺；g-苯乙胺圖3 冷浸漬、酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)組中生物胺的質(zhì)量濃度Fig.3 The concentrations of biogenic amines in wines after cold maceration, alcoholic fermentation and malolactic fermentation

冷浸漬結(jié)束后，NTd-CM中組胺(6.59 mg/L)、酪胺(2.25 mg/L)、精胺(0.72 mg/L)和亞精胺(0.67 mg/L)的質(zhì)量濃度最低；LTd-CM中腐胺(2.82 mg/L)質(zhì)量濃度最低；而HTd-CM則尸胺(0.12 mg/L)和苯乙胺(0.14 mg/L)質(zhì)量濃度最低。酒精發(fā)酵后，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中腐胺、亞精胺、苯乙胺的質(zhì)量濃度均明顯上升，而酪胺和尸胺則有所下降。添加Td3酵母的實(shí)驗(yàn)組(LTd-AF和HTd-AF)中組胺、酪胺的質(zhì)量濃度均明顯低于NTd-AF，并且HTd-AF中組胺(5.68 mg/L)、精胺(0.88 mg/L)、亞精胺(1.74 mg/L)和苯乙胺(0.41 mg/L)質(zhì)量濃度最低，相比于NTd-AF，降幅分別為26.23%、10.20%、2.24%和33.87%。蘋乳發(fā)酵后，組胺的質(zhì)量濃度大幅增加，增加比例為33.77%～36.09%。HTd-MF中具有最低質(zhì)量濃度的組胺、腐胺、尸胺、精胺和苯乙胺，與NTd-MF差異顯著，分別下降了24.95%、68.42%、25.86%、40.98%和15.94%，而LTd-MF中這些生物胺的降幅卻不明顯。在冷浸漬階段接種高濃度的Td3酵母(1×107CFU/mL)能夠明顯降低葡萄酒中生物胺的質(zhì)量濃度，這可能是由于Td3酵母的大量生長(zhǎng)抑制了其他微生物的代謝活動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致最終葡萄酒中生物胺質(zhì)量濃度的降低。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，在冷浸漬開(kāi)始階段接種戴爾有孢圓酵母Td3能夠顯著增加丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和苯乙醇的質(zhì)量濃度，同時(shí)降低生物胺，尤其是組胺的質(zhì)量濃度，有效提升干紅葡萄酒香氣和安全品質(zhì)。并且，接種高濃度Td3酵母(1×107CFU/mL)對(duì)干紅葡萄酒品質(zhì)的提升效果最佳。上述結(jié)果表明，在冷浸漬開(kāi)始階段接種優(yōu)良戴爾有孢圓酵母是提升干紅葡萄酒品質(zhì)的有效手段，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)安全的干紅葡萄酒提供了實(shí)踐指導(dǎo)。