劉瑞峰 賈桂霞

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院 長沙 410004； 2.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國家花卉工程技術(shù)研究中心花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室 北京 100083)

植物在長期適應(yīng)環(huán)境過程中進化出了強大的信號網(wǎng)絡(luò)和多層次的防御機制來應(yīng)對威脅，其中，水楊酸(Salicylic acid，SA)和茉莉酸/乙烯(jasmonic acid/ethylene，JA/ET)信號途徑在植物抵御病原菌侵染中具有重要作用(Derksenetal., 2013)。通常認為，水楊酸抗病信號途徑主要調(diào)控植物抵御活體營養(yǎng)型病原菌(biotrophs pathogen)的侵染，茉莉酸/乙烯信號途徑則主要介導(dǎo)植物抵御死體營養(yǎng)型病原菌(necrotrophs pathogen)的侵染。植物以何種途徑介導(dǎo)半活體營養(yǎng)型病原菌(hemibiotrophic pathogen)的侵染，則取決于寄主植物和病原菌互作體系的具體情況，互作體系不同，其抗病防衛(wèi)反應(yīng)途徑也可能不同(Achuoetal.,2004； Smithetal., 2009； Sanchezetal., 2012； Zuluagaetal., 2016)。

月季黑斑病菌(Diplocarponrosae)屬半活體營養(yǎng)型病原菌(Gachomoetal., 2006)。月季在抵御黑斑病中的激素抗病信號途徑尚不明確。在筆者前期的研究中發(fā)現(xiàn)： 中抗月季材料‘粉和平’接種后PAL呈下降趨勢； 以‘粉和平’接種前后24、48和72 h RNAs的等量混合樣進行轉(zhuǎn)錄測序，結(jié)果表明乙烯響應(yīng)因子ERF1和ERF3(ethylene response factor 3)，丙二烯氧化合成酶基因AOS(allene oxide synthase)，赤霉素受體蛋白基因GIDI(GA-insenshive dwarf l)，植物生長素-氨基酸合成酶基因GH3(IAA-amido synthetase)，脫落酸受體基因PYR/PYL(pyrabactin resistance/PYR1-like)、TGA和MYC2轉(zhuǎn)錄因子在‘粉和平’接種后上調(diào)表達(未發(fā)表，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)見https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/6323271和https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/6323272)。這些結(jié)果說明水楊酸信號途徑可能受到病原菌的抑制； SA，JA/ET，ABA、GA和IAA信號途徑可能共同參與月季對黑斑病菌的響應(yīng)。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得水楊酸和茉莉酸信號途徑部分關(guān)鍵基因序列，并在外源水楊酸和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)誘導(dǎo)和接種(inoculation，IN)條件下，監(jiān)測其表達動態(tài)，探索水楊酸、茉莉酸/乙烯抗病信號途徑在月季響應(yīng)黑斑病菌過程中調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以前期離體接種黑斑病菌(cfcc87205)篩選獲得的中抗月季品種‘粉和平’(Rosa‘MEIbil’)(在測定的60份月季材料中，抗性相對較強)為材料，發(fā)病潛伏期為13～15天，病情指數(shù)12.3。

黑斑病菌購自中國林業(yè)科學(xué)研究院菌種保藏管理中心(編號: cfcc87205)。 接種孢子采用活化后的一代孢子，即將購買的菌種活化后接種到滅菌的月季葉片上，再將感病的葉片切成5 mm的小塊并轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，23 ℃恒溫增殖培養(yǎng)25天(Debeneretal.,1998)。

1.2 試驗設(shè)計及接種

選取30株健康植株，接種前一年冬季對其進行修剪，保留高度10 cm。第2年春季，在葉片生長6～8周進行取樣接種。每株摘取健康、中等成熟的完全伸展葉1～2片，用自來水沖去葉片表面塵土，將其放入2%的次氯酸鈉溶液中浸泡4 min殺菌，再用無菌水沖洗3次，將葉片正面向上放在鋪有濕潤濾紙的托盤上(33 cm×23 cm×10 cm)。試驗共5個處理，無菌水誘導(dǎo)2 h后接種(CK+IN)，水楊酸誘導(dǎo)2 h不接種(SA+NO)，水楊酸誘導(dǎo)2 h后接種(SA+IN)，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)2 h不接種(JA+NO)和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)2 h后接種(JA+IN)，設(shè)置空白對照CK。首先，將葉片分為3組： 分別霧狀噴施等量蒸餾水(CK和CK+IN處理)、2 mmol·L-1的水楊酸(SA+NO和SA+IN處理)和0.2 mmol·L-1的茉莉酸甲酯水溶液(JA+NO和JA+IN處理)，噴施后用保鮮薄膜密封。2 h后揭開保鮮膜，用吸水紙吸干葉片表面的液滴，然后以每葉2.5 mL的量噴施1×105個·mL-1孢子懸浮液(0.01%的Tween-20)接種(CK+IN，SA+IN和JA+IN處理)，非接種處理(SA+NO和JA+NO處理)和空白對照CK噴施等量的無菌水(0.01%的tween-20)。以濕潤的無菌棉包裹葉柄，以保鮮膜封口，將其置于23 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，光照時間每天12 h。每個處理至少5個生物重復(fù)。

以半活體營養(yǎng)型病原菌攝取營養(yǎng)特征(前期以活體營養(yǎng)型菌方式攝取營養(yǎng)，后期以死體營養(yǎng)型病原菌的方式攝取營養(yǎng))、黑斑病菌侵入進程(病菌侵入顯微觀測表明，接種16 h多數(shù)病原菌萌發(fā)出芽管刺入或者已經(jīng)刺入葉片)和月季奇數(shù)羽狀5小葉為依據(jù)，取樣5次，即接種后16、 24、48、72 和144 h，每次順序取全葉的其中一小葉，以無菌水沖洗掉葉片表面攜帶的病原體，擦干后迅速置于液氮中保存。

1.3 RNA提取純化和cDNA合成

葉片總RNA采用北京艾德萊生物科技有限公司(Aidlab Biotechnologies Co., Ltd) RNA38試劑盒提取。以RNA為模板，Oligo (dT)17為引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase M-MLV，Promega)指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄體系將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈。

1.4 引物設(shè)計與基因表達量計算

根據(jù)Niu等(2014)的方法，將基于轉(zhuǎn)錄組測序獲得相關(guān)基因unigenes全部挑選出來并翻譯成氨基酸序列，在網(wǎng)站下載同屬和不同屬參考物種的目標基因蛋白序列，以MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與同屬目標基因親緣關(guān)系最近且系統(tǒng)發(fā)育順序正確的unigene確定為目標基因序列。

在NCBI上查找正確序列的保守結(jié)構(gòu)域，避開保守結(jié)構(gòu)域以Primer5設(shè)計特異性熒光定量引物，以擴增效率95%

表1 目標基因的引物序列及RT-PCR退火溫度Tab.1 The sequences and annealing temperatures of the RT-PCR primers for target genes

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用一般線性模型單因素方差分析(P<0.05)進行基因表達量差異分析(SPSS18.0)，在每個取樣時間點，比較不同處理間的基因表達量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸信號途徑關(guān)鍵基因的表達分析

2.1.1 異分支酸合成酶基因(ICS)表達分析ICS主要負責病原菌誘導(dǎo)下植物體內(nèi)水楊酸的合成。與對照CK相比，SA+NO處理中，ICS在16和144 h下調(diào)表達、在24 h與CK中無顯著差異，在48和72 h上調(diào)表達(P<0.05)； JA+NO處理中，ICS在24、48和72 h上調(diào)表達、在16和144 h下調(diào)表達(P<0.05)； CK+IN處理中，ICS在16、24和144 h下調(diào)表達、在48和72 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)。SA+IN處理中，ICS的表達量除了在24和72 h與CK+IN處理中無顯著差異外其余時間點ICS上調(diào)表達(P<0.05)； JA+IN處理中，ICS在16 h下調(diào)表達、在72 h與其在CK+IN處理中無顯著差異、其余時間點ICS上調(diào)表達(P<0.05)(圖1A)。

圖1 ICS在不同取樣時間的相對表達量Fig.1 The relative expression of ICS in different sampling points

從ICS表達量動態(tài)來看，CK+IN處理中，ICS下調(diào)表達； 相對于CK+IN處理，SA+NO、SA+IN、JA+NO和JA+IN處理都能在24～144 h提高ICS的表達，且JA+NO和JA+IN處理對ICS的提升效果更好，但接種16 h，SA+NO、JA+NO和JA+IN處理都下調(diào)了ICS的表達而SA+IN處理則上調(diào)了ICS的表達(圖1B)。

以上結(jié)果表明，接種初期(16 h)，SA+IN處理可增強ICS表達，而JA+IN處理可降低ICS的表達； 接種24～144 h，外源水楊酸和茉莉酸都能提高ICS的表達，且外源茉莉酸對ICS的提升效果更好。ICS在SA+IN中的波動變化表明病原菌對外源水楊酸更為敏感，所表現(xiàn)的反饋抑制作用較強。

2.1.2NPR1表達分析NPR1除正向調(diào)控PR1表達外，還在水楊酸和茉莉酸信號途徑的交互和轉(zhuǎn)換中起重要作用(Robert-Seilaniantzetal.， 2011)。SA+NO處理中，NPR1在16和24 h上調(diào)表達、在48和72 h下調(diào)表達、在144 h與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，NPR1在16和144 h上調(diào)表達、在24、48和72 h下調(diào)表達(P<0.05)； CK+IN處理中，NPR1在16 h上調(diào)表達、在24 h與CK處理中無顯著差異、在48、72和144 h下調(diào)表達(P<0.05)。SA+IN處理中，NPR1在16、24、48和144 h上調(diào)表達、在72 h與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，NPR1在16、24和72 h上調(diào)表達，在48和144 h與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)(圖2A)。

圖2 NPR1在不同取樣時間的基因相對表達量Fig.2 The relative expression of NPR1 in different sampling points

從NPR1表達量動態(tài)來看，在接種16～48 h間，CK+IN、SA+NO、SA+IN、JA+NO和JA+IN處理中，NPR1呈下降趨勢，但JA+NO處理中，NPR1表達量最小，下降速度最快，其次是CK+IN處理。接種48～144 h間NPR1表達量在CK+IN、SA+NO、SA+IN和JA+IN處理中趨近且變化平緩，JA+NO處理中NPR1表達量在72～144 h間呈增強趨勢(圖2B)。

以上結(jié)果表明，NPR1在接種早期短暫上調(diào)后迅速被病原菌抑制； SA+NO處理在接種早期促進NPR1表達，JA+NO處理在接種早期抑制NPR1表達，SA+IN和JA+IN處理都能提高NPR1的表達，降低病原菌對NPR1的抑制作用。

2.1.3PR1表達量分析PR1是水楊酸信號途徑的標記基因，SA+NO處理中，PR1在16和48 h下調(diào)表達、在72 h 上調(diào)表達、在24和144 h與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，PR1在16、24和48 h下調(diào)表達、在72 h上調(diào)表達、在144 h與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，PR1除在48 h下調(diào)表達外其余各點與其在CK處理中無顯著差異(P<0.05)。SA+IN處理中，PR1在24、72和144 h上調(diào)表達、在16和48 h與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，PR1在24和48 h與其在CK+IN處理中無顯著差異、在16、72和144 h則顯著上調(diào)表達(P<0.05)(圖3A)。

從PR1表達量動態(tài)變化來看，CK+IN處理中，PR1與對照曲線趨近。SA+IN處理可增強PR1表達，JA+IN處理也可提高PR1的表達量。SA+NO和JA+NO處理中，PR1在接種16 ～48 h呈下調(diào)趨勢，48 h后呈表達增強趨勢且增強幅度較SA+IN和JA+IN處理中較小(圖3B)。

圖3 PR1在不同取樣時間的基因相對表達量Fig.3 The relative expression of PR1 in different sampling points

以上結(jié)果說明，病原菌影響外源激素對月季的誘導(dǎo)表達； SA+IN處理和JA+IN處理可提高PR1表達，且在接種48 h后提升幅度較大，相對于JA+IN處理，SA+IN處理對PR1的上調(diào)作用更為顯著。

綜合水楊酸信號途徑3個關(guān)鍵基因來看，病原菌對水楊酸信號途徑ICS和NPR1有不同程度的抑制作用，PR1沒有激活或被抑制； SA+IN處理能提高各基因的表達，且在接種48 h后對ICS和PR1提高幅度較大； JA+IN處理在接種48 h后也可增強ICS和PR1的表達。病原菌對外源水楊酸誘導(dǎo)更為敏感，主要表現(xiàn)在，SA+IN處理中，水楊酸信號途徑關(guān)鍵基因ICS和PR1都呈波動變化。

2.2 茉莉酸信號途徑關(guān)鍵基因的表達分析

2.2.1AOS表達分析AOS參與茉莉酸的合成，SA+NO處理中，AOS在16和48 h顯著上調(diào)表達、在72 h顯著下調(diào)表達、在24和144 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，AOS在16、48和144 h上調(diào)表達、在72 h下調(diào)表達、在24 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，AOS在16 h上調(diào)表達、在72 h下調(diào)表達、在24、48和144 h與CK處理中無顯著差異。與CK+IN處理相比，AOS在SA+IN處理中除在接種48 h與CK+IN處理中無顯著差異外、其余各點均上調(diào)表達(P<0.05)，JA+IN處理中，AOS除在接種144 h與CK+IN處理中無顯著差異外、其余各點均上調(diào)表達(P<0.05)(圖4A)。

從AOS表達動態(tài)來看，病原菌在侵入16 h誘導(dǎo)AOS上調(diào)表達，之后變化趨勢與對照趨近； SA+NO、JA+NO、SA+IN和JA+IN處理都能提高AOS的表達且在48 h前對AOS表達量的提升幅度較大； JA+NO處理則在72 h后對AOS表達量的提升幅度最大(圖4B)。以上結(jié)果表明，病原菌侵入早期誘導(dǎo)AOS上調(diào)表達，侵入中后期，對AOS影響不大或下調(diào)AOS表達； 外源水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)都能提高AOS的表達、且在病菌侵入48 h前提升幅度較大。

圖4 AOS在不同取樣時間的基因相對表達量Fig.4 The relative expression of AOS in different sampling points

2.2.2JAR1表達分析 SA+NO處理中，JAR1在16 h下調(diào)表達、在72 h上調(diào)表達、在24、48和144 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，JAR1在16 h下調(diào)表達、在24、48和72 h上調(diào)表達、在144 h則與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，JAR1除在16 h下調(diào)表達外其余各監(jiān)測點與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，JAR1除在24 h上調(diào)表達外其余監(jiān)測點與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； SA+IN處理中，JAR1表達量在監(jiān)測的各個時間點都與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)(圖5A)。

從JAR1在各處理中的表達動態(tài)來看，CK+IN處理只在接種初期抑制JAR1表達，JA+NO和JA+IN處理能夠在接種24～144間提高JAR1表達，且JA+IN處理減弱了JA+NO處理對JAR1的上調(diào)作用； SA+NO和SA+IN處理對JAR1表達影響相對較小(圖5B)。

圖5 JAR1在不同取樣時間的基因相對表達量Fig.5 The relative expression of JAR1 in different sampling points

以上結(jié)果表明，接種16 h病原菌對JAR1有抑制作用，外源水楊酸和茉莉酸都沒有減輕病原菌對JAR1的抑制作用； 外源茉莉酸可在接種24～144 h上調(diào)JAR1表達，但接種48 h后對JAR1上調(diào)作用減弱； 外源水楊酸對JAR1的表達影響相對較小。

2.2.3COI1表達分析 SA+NO處理中，COI1在16、72和144 h和CK處理中無顯著差異、在24和48 h顯著下調(diào)表達(P<0.05)； JA+NO處理中，COI1在16、48和72 h與CK處理中無顯著差異、在24和144 h則顯著下調(diào)表達(P<0.05)； CK+IN處理中，COI1在24、48和72 h顯著上調(diào)表達，在16和144 h則與CK處理中無顯著差異(P<0.05)。SA+IN和JA+IN處理中，COI1表達量除在16 h與其在CK+IN處理中無顯著差異外、其余各個時間點COI1的表達量顯著下調(diào)(P<0.05)(圖6A)。

從COI1表達量變化來看，接種24～72 h，病原菌可誘導(dǎo)COI1的上調(diào)表達； SA+NO、SA+IN、JA+NO和JA+IN處理都能下調(diào)COI1的表達，相對于外源茉莉酸，外源水楊酸誘導(dǎo)后，COI1在接種48 h后下調(diào)明顯(圖6B)。這說明病原菌誘導(dǎo)COI1上調(diào)表達，外源水楊酸和茉莉酸都能下調(diào)COI1的表達、減弱病原菌對COI1的誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖6 COI1在不同取樣時間的基因相對表達量Fig.6 The relative expression of COI1 in different sampling points

2.2.4MYC2的表達量分析 SA+NO處理中，MYC2在16和24 h顯著上調(diào)表達、在72 h顯著下調(diào)表達、在48和144 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+NO處理中，MYC2在16和48 h上調(diào)表達、在72和144 h下調(diào)表達、在24 h與CK處理中無顯著差異(P<0.05)； CK+IN處理中，MYC2除在16 h上調(diào)表達、在48 h與CK處理無顯著差異外、其余各個監(jiān)測點MYC2顯著下調(diào)表達(P<0.05)。相對于CK+IN處理，SA+IN處理中，MYC2在24、72和144 h顯著上調(diào)表達、在16和48 h則與其在CK+IN處理中無顯著差異(P<0.05)； JA+IN處理中，MYC2除在48 h與CK+IN處理無顯著差異外、其余各個監(jiān)測點MYC2顯著上調(diào)表達(P<0.05)(圖7A)。

從MYC2的表達量變化來看，接種后，MYC2在整個監(jiān)測期呈波動變化，接種初期表達增強，此后波動下調(diào)； SA+NO和JA+NO處理在48 h前可提高MYC2表達，在72～144 h可降低MYC2表達； JA+IN處理在16～144 h提高MYC2表達； SA+IN處理在接種16～48 h能減弱病原菌對MYC2的誘導(dǎo)效應(yīng)，接種48～144 h提高MYC2表達(圖7B)。

圖7 MYC2在不同取樣時間的基因相對表達量Fig.7 The relative expression of MYC2 in different sampling points

以上結(jié)果表明，病原菌改變外源激素對月季MYC2的誘導(dǎo)表達； 病原菌只在接種初期誘導(dǎo)MYC2表達增強； 接種48 h前SA+IN處理可削弱病原菌對MYC2的誘導(dǎo)效應(yīng)、接種48 h后SA+IN處理可提高MYC2表達； JA+IN處理則提高MYC2表達。

綜合分析4個茉莉酸信號途徑的關(guān)鍵基因，接種16 h，AOS和MYC2上調(diào)、JAR1下調(diào)表達，接種24～144 h，COI1的表達增強、AOS和JAR1與CK處理相差不大、MYC2波動下調(diào)； JA+IN處理可下調(diào)COI1表達、增強AOS、JAR1和MYC2的表達； SA+IN處理可增強AOS表達、降低COI1表達、對JAR1表達影響不大，在接種16～48 h能削弱病原菌對MYC2的誘導(dǎo)效應(yīng)，在接種72～144 h增強MYC2表達。

3 討論

前期生理試驗發(fā)現(xiàn)，月季接種黑斑病菌后PAL活性下降； 轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果表明，水楊酸信號途徑中的關(guān)鍵基因ICS、NPR1和PR1的表達量在接種和對照組間無顯著差異； 實時熒光定量監(jiān)測表明，接種后ICS下調(diào)表達，PR1在接種48 h下調(diào)表達，其余時間點與CK處理中無顯著差異； 這些結(jié)果說明，月季-黑斑病菌的親和互作體系中，不管是PAL還是ICS負責SA的合成，病原菌都對水楊酸信號途徑具有抑制作用。與CK+IN處理相比，水楊酸信號途徑的關(guān)鍵基因ICS、NPR1、PR1在SA+IN處理中上調(diào)表達，這說明外源水楊酸誘導(dǎo)能夠減弱病原菌對水楊酸信號途徑的抑制作用。試驗還發(fā)現(xiàn)，JA+IN處理在接種16 h降低ICS表達，在接種48 h后可同時增強ICS和PR1的表達，這說明外源茉莉酸在接種初期抑制SA的合成，接種中后期卻能同外源水楊酸一樣降低病原菌對水楊酸信號系統(tǒng)的抑制作用。

在對茉莉酸信號途徑相關(guān)基因的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，CK+IN處理中，AOS在接種16和72 h上調(diào)表達，JAR1在16 h下調(diào)表達、其余時間JAR1表達量與其在CK處理中無顯著差異，COI1卻在接種24～72 h上調(diào)表達，外源水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)能不同程度地降低COI1的表達。這些結(jié)果說明，月季接種后COI1的上調(diào)表達并不依賴于JA-Ile的合成，黑斑病菌侵入月季后可能并沒有激活月季的茉莉酸防御系統(tǒng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，某些病原菌能夠通過對COI1的調(diào)節(jié)來增強其毒性，并進一步抑制植物的防御系統(tǒng)(Kloeketal., 2001； Ralhanetal., 2012； Gengetal., 2016)，據(jù)本研究可以推測，黑斑病菌可能通過調(diào)控COI1的上調(diào)表達來增強其毒性，外源水楊酸和茉莉酸處理能減弱病原菌的毒性。MYC2是水楊酸和茉莉酸/乙烯信號途徑的負調(diào)控因子(Dombrechtetal., 2007； Kazanetal., 2013)，本研究發(fā)現(xiàn)JA+IN處理不僅減弱JA+NO處理對JAR1的上調(diào)表達趨勢，且在增強AOS和JAR1表達的同時，也能增強MYC2的表達，這說明病原菌對JAR1有抑制作用，即使外源茉莉酸或病原菌誘導(dǎo)促進活性茉莉酸的合成，黑斑病菌也會通過增強MYC2的表達來抑制茉莉酸/乙烯信號防御途徑。相對于CK+IN處理，SA+IN處理中，MYC2在接種16～48 h能削弱病原菌對MYC2誘導(dǎo)效應(yīng)； 在接種72～144 h卻提高MYC2的表達； 進一步聯(lián)合分析SA+IN中MYC2與PR1的表達量變化發(fā)現(xiàn)，接種48 h前MYC2的表達量變化趨勢與PR1正好相反，接種48 h后在PR1表達增強的同時MYC2的表達也增強，這些結(jié)果表明，病原菌可能通過調(diào)控MYC2的變化影響PR1的表達，黑斑病菌侵入月季的過程是黑斑病菌與月季免疫防御系統(tǒng)不斷博弈的過程，黑斑病菌侵入初期，外源水楊酸所誘導(dǎo)的PR1的增強表達與病原菌所引起MYC2的增強表達處于“膠著對壘”階段，PR1表達與MYC2呈相反變化趨勢； 而隨黑斑病菌侵入時間的延長和侵入程度的加深，這種膠著狀態(tài)已經(jīng)被打破，黑斑病菌已處于優(yōu)勢地位，盡管PR1的表達量在持續(xù)增加，病原菌適應(yīng)PR1增強而表現(xiàn)出的對MYC2的上調(diào)作用也在增大。黑斑病菌作為一種半活體營養(yǎng)型病原菌，一旦從月季的死亡細胞中吸收營養(yǎng)物質(zhì)，它就可能觸發(fā)月季的茉莉酸/乙烯信號防御系統(tǒng)(Smithetal.， 2009)，本試驗中，ICS、NPR1、PR1、AOS、JAR1和MYC2的表達量在SA+IN和JA+IN處理中都在接種48 h出現(xiàn)了轉(zhuǎn)折性的改變，這表明病原菌可能在48 h發(fā)生營養(yǎng)吸收方式的根本性改變，進而導(dǎo)致其所誘發(fā)的抗病途徑也由水楊酸信號途徑轉(zhuǎn)向茉莉酸/乙烯信號途徑。這也就解釋了SA+IN 處理中PR1的表達量在接種48 h后出現(xiàn)較大增幅的原因，即并不是由于病原菌激活了水楊酸信號途徑，而是病原菌對水楊酸信號途徑的抑制作用減弱。同樣，JA+IN處理中，AOS、JAR1和MYC2在接種48 h前表達量較高、相對CK+IN處理增幅較大，而在接種48 h后表達量較低、相對CK+IN處理增幅較小，也是由于病原菌在接種48 h前對茉莉酸信號途徑的抑制作用較弱，在接種48 h后對茉莉酸/乙烯信號途徑的抑制作用增強的緣故，且MYC2的增強表達與茉莉酸/乙烯信號途徑被抑制直接相關(guān)。這就意味著病原菌可能通過調(diào)控MYC2的上調(diào)表達實現(xiàn)其對月季水楊酸和茉莉酸/乙烯免疫防御系統(tǒng)的雙重抑制。這一機制與半活體營養(yǎng)型致病菌丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的致病機制極為類似，研究發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌 Pst DC3000可利用FALF23(Rapid alkalinization factor)對受體激酶FER (FERONIA)的負調(diào)控作用，促進MYC2穩(wěn)定和高表達，并以此破壞植物的免疫防御系統(tǒng)(Xinetal.， 2013；Stegmannetal.， 2017；Guoetal.， 2018)。最新研究表明薔薇屬植物中也發(fā)現(xiàn)了與激素調(diào)控和病菌侵染有關(guān)的FALF-like基因(Zhangetal.， 2020)。這些研究結(jié)果有力地支撐了本試驗結(jié)論，并為今后月季的抗黑斑病機制研究提供了新的思路。

本試驗中MYC2在CK+IN中的波動下調(diào)表達與轉(zhuǎn)錄組測序MYC2上調(diào)表達結(jié)果不一致，這是由于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)是接種前后24～72 h間3個不同時間點的混合樣測定分析結(jié)果，而本次試驗是接種前后16～144 h間共5個時間點的表達動態(tài)，另外，本次試驗取樣批次與轉(zhuǎn)錄組測序取樣批次不同也是造成二者不一致的原因，但在本試驗中CK+IN處理中MYC2的動態(tài)下調(diào)表達與ICS下調(diào)表達是一致的，因此，本試驗結(jié)論符合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。

本試驗的不足之處是： 沒有獲得適宜的引物來監(jiān)測茉莉酸/乙烯信號途徑ERF1和PDF1.2(plant defension 1.2)的表達變化； 雖然通過病菌侵入顯微觀測結(jié)果確定接種16 h為最初取樣點，但從試驗數(shù)據(jù)可以看出，接種16 h很可能已是月季抗病信號初始反應(yīng)的末期。然而，從接種16 hICS和JAR1在CK+IN處理中下調(diào)表達而AOS和MYC2上調(diào)表達可再次確定，病原菌誘導(dǎo)的MYC2的上調(diào)表達與月季水楊酸和活性茉莉酸的合成被抑制密切相關(guān)。

綜合各基因在接種及外源水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)下的表達量差異和動態(tài)曲線可知，黑斑病菌可能通過調(diào)控月季體內(nèi)MYC2上調(diào)表達來實現(xiàn)對月季水楊酸和茉莉酸/乙烯信號防御系統(tǒng)的雙重抑制。鑒于黑斑病菌這一入侵策略，月季的茉莉酸/乙烯信號防御途徑可能被病原菌一直抑制或者根本無法激活，月季抗病性的強弱將更多地決定于病原菌誘導(dǎo)后水楊酸防御系統(tǒng)啟動的早晚和持續(xù)的時間，外源水楊酸及其類似物誘導(dǎo)雖然能在一定程度上提高月季的抗病性，但其效果將十分有限。

4 結(jié)論

在月季-黑斑病親和互作體系中，黑斑病菌通過抑制水楊酸和活性茉莉酸的合成而對月季水楊酸和茉莉酸/乙烯抗病防御系統(tǒng)有抑制作用，黑斑病菌在接種48 h前主要抑制水楊酸信號途徑、在接種48 h后主要抑制茉莉酸/乙烯信號途徑。病原菌可能通過操縱月季MYC2的上調(diào)表達來實現(xiàn)對月季水楊酸和茉莉酸/乙烯信號途徑的雙重抑制。