牛星堂 林珣珣 朱昭煒 許澍洽 唐慶

[摘要]目的：探討4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone，4MU）對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的作用及機(jī)制研究。方法：體外培養(yǎng)的原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFs）分別用濃度為0、0.2、0.4、0.8mM的4MU處理，采用CCK-8法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4MU對(duì)KFs細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，通過ELISA、qPCR、免疫熒光染色和Western-bloting技術(shù)檢測(cè)4MU對(duì)KFs炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響。結(jié)果：4MU不僅抑制KFs細(xì)胞增殖遷移，而且可減少KFs對(duì)IL-6和IL-8的分泌，同時(shí)抑制HAS2和HAS3 mRNA的表達(dá)及α-SMA、TLR4、CD44、NF-κB1、P65蛋白的合成。結(jié)論：4MU可以抑制KFs增殖和遷移，并可通過抑制NF-κB通路相關(guān)基因的表達(dá)，減少KFs炎癥因子分泌，因此，4MU有可能成為治療瘢痕疙瘩的新藥物。

[關(guān)鍵詞]4-甲基傘形酮;瘢痕疙瘩;炎癥因子;TLR4;NF-κB1;作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）07-0097-04

Abstract： Objective? To investigate the effect of 4-methylumbelliferone （4MU） on keloid fibroblasts （KFs）. Methods? Primary keloid fibroblasts were respectively treated with 4MU at concentrations of 0， 0.2， 0.4， and 0.8 mM. The proliferation and migration ability of KFs were detected by CCK-8 assay and cell migration assay. ELISA， qPCR， immunofluorescence and Western-bloting techniques were applied to study the effects of 4MU on the expression of inflammation-related genes in KFs. Results? 4MU not only inhibited the proliferation and migration of KFs， but also inhibited the secretion of IL-6 and IL-8. Additionally， 4MU inhibited the expression of HAS2 and HAS3， and reduced the synthesis of α-SMA， TLR4， CD44， NF-κB1 and P65 proteins in KFs. Conclusion? 4MU treatment can not only inhibit the activity of KFs， but also decrease the secretion of inflammatory by down-regulating the expression of NF-κB signal pathway. Therefore， 4MU has the potential to be a new drug for the cure of keloids.

Key words： 4-methylumbelliferone; keloid; inflammatory factors; TLR4; NF-κB1; mechanism of action

瘢痕疙瘩是一種臨床常見的成纖維細(xì)胞過度增殖性疾病，常繼發(fā)于各種皮膚損傷，多見于胸前區(qū)和耳垂，其病理特征主要表現(xiàn)為真皮增厚、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）增多及新生血管形成[1]。盡管目前存在多種治療策略[2]，如手術(shù)切除、局部糖皮質(zhì)激素類藥物注射和放射治療等[3-4]，但瘢痕疙瘩的治療抵抗性和高復(fù)發(fā)率一直困擾著醫(yī)生和患者。有研究認(rèn)為瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Keloid fibroblasts，KFs）是瘢痕疙瘩形成的主要細(xì)胞，在瘢痕疙瘩發(fā)展過程中被持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)激活，繼而引起相應(yīng)病理改變[5]。此外，透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）作為ECM主要構(gòu)成成分之一，在大多數(shù)損傷組織中，由透明質(zhì)酸合成酶（Hyaluronan synthases，HAS）合成，隨后被迅速清除，然而，在自身免疫性疾病病灶中HA可持續(xù)存在[6]。

4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone，4MU）是一種香豆素衍生物，也被命名為7-羥基4-甲基香豆素。已有多項(xiàng)研究證實(shí)4MU對(duì)HA合成具有顯著抑制作用[7-9]。近年來已有多項(xiàng)研究表明4MU在多發(fā)性硬化、1型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等人類疾病動(dòng)物模型中可以預(yù)防纖維化和抑制自身免疫[10-13]。而且，目前已有4MU相關(guān)藥物用于治療膽道相關(guān)疾病。但是，4MU對(duì)KFs是否具有治療作用仍然未知，因此，本研究擬通過不同濃度4MU處理KFs，探討4MU在瘢痕疙瘩中對(duì)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的影響，從而為瘢痕疙瘩的治療提供新策略。

1? 材料和方法

1.1 主要材料：本實(shí)驗(yàn)已通過中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，倫理審批號(hào)為[2019]229。瘢痕疙瘩樣本來源于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織。標(biāo)本來源患者平均年齡32歲，均已獲得患者對(duì)標(biāo)本使用的許可。

主要試劑：4MU（純度>99%）購買于MedChem Express公司，溶于DMSO中，儲(chǔ)備濃度為1 000mM，儲(chǔ)存于-20℃，使用濃度中DMSO濃度小于0.1%，對(duì)KFB的影響可以忽略不計(jì)。DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素均采購自Gibco公司;CCK-8試劑盒購買自ApexBio公司;TRIzol?試劑和RIPA裂解緩沖液購買自Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自Thermo公司;SYBR-GREEN-PCR試劑盒和ELISA試劑盒購買自Yesen公司;10%預(yù)制凝膠和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購買自ABSIN公司;實(shí)驗(yàn)所用抗體均購買自Proteintech公司;實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：手術(shù)中切除的瘢痕疙瘩標(biāo)本置于50ml無菌離心管內(nèi)并立即保存在冰盒中送往實(shí)驗(yàn)室。超凈臺(tái)內(nèi)，使用無菌剪刀將瘢痕疙瘩組織表皮去除，真皮組織剪碎成約2mm大小，隨后置于含有0.2% Ⅱ型膠原酶和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃恒溫水浴鍋震蕩消化6h，待組織完全消化后，100μm無菌濾網(wǎng)過濾，過濾液1 000rpm離心5min，用5ml PBS重懸沉淀并再次離心，所得細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)（37℃，5% CO2）。實(shí)驗(yàn)中將4MU稀釋至所需濃度（0mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM）分別處理細(xì)胞。本研究所用細(xì)胞均為第3～6代細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)：細(xì)胞消化離心后計(jì)數(shù)，每孔1.0×103個(gè)細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板，含10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，細(xì)胞貼壁后，更換為含有不同濃度4MU的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。之后每隔一天使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。具體方法為：棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入100μl培養(yǎng)基和10μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中避光放置3h，使用酶標(biāo)儀（Bio-Tek EPOCH2，美國(guó)）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，每組有5個(gè)重復(fù)孔，所有檢測(cè)均在3個(gè)不同細(xì)胞樣本中重復(fù)進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：KFs接種于6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞覆蓋率達(dá)到90%時(shí)，PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，用200μl移液管尖端用力刮除細(xì)胞，使用含有不同濃度4MU的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0h及48h后拍照。

1.2.4 qPCR檢測(cè)：使用TRIzol?試劑從KFs中提取總RNA，根據(jù)說明書使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR-GREEN-PCR試劑盒在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀（Bio-Rad-CFX96，美國(guó)）中進(jìn)行定量PCR（qPCR）分析，以GAPDH為參考基因，2-△△ct值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)情況，計(jì)算HAS2、HAS3、IL-6、IL-8的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下，IL-6引物：CCTGACCCAACCACAAATGC和CCTGACCCAACCACAAATGC;IL-8引物：TCCTGATTTCTGCAGCTCTGTGTG和AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG;HAS2引物：CTCTTTTGGACTGTATGGTGCC和AGGGTAGGTTAGCCTTTTCACA;HAS3引物：CAGCCTATGTGACGGGCTAC和CCTCCTGGTATGCGGCAAT;GAPDH引物：TGTGGGCATCAATGGATTTGG和ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。每項(xiàng)均設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，所有檢測(cè)均在3個(gè)細(xì)胞樣本中重復(fù)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)：含有不同濃度4MU的10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)KFs 48h后，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，和適量蛋白緩沖液混合并95℃加熱變性。取等量蛋白加到10%預(yù)制凝膠（Precast PAGE Gel）中，電泳分離并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜浸沒在5%脫脂牛奶中，室溫孵育120min。隨后用特異性一抗和二抗孵育并使用化學(xué)發(fā)光液顯影，檢測(cè)TLR-4、CD44、NF-κB1和P65的蛋白表達(dá)情況。GAPDH作為內(nèi)參蛋白，實(shí)驗(yàn)所用抗體除GAPDH和P65抗體是鼠源抗體外，其余均為兔源抗體。

1.2.6 ELISA檢測(cè)：含有不同濃度4MU的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)KFs 48h后，收取培養(yǎng)基，離心去除細(xì)胞碎片，根據(jù)ELISA試劑盒使用說明，檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6和IL-8含量[12]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)量的吸光度。實(shí)驗(yàn)在3種不同細(xì)胞樣本中重復(fù)。

1.2.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)皿中種入0.5×103個(gè)KFs，待細(xì)胞貼壁后，分別使用含0mM和0.4mM 4MU的FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，4%多聚甲醛固定30min，隨后分別用α-SMA一抗，NF-κB1和P65一抗孵育，放置4℃過夜，將細(xì)胞與不同熒光二抗在室溫下孵育1h。用DAPI孵育染色細(xì)胞核核，并使用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)拍攝照片。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用軟件GraphPad Prism 7進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析比較各組間差異。當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 4MU對(duì)KFs增殖的影響：經(jīng)CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4MU對(duì)KFs的增殖具有明顯的抑制作用（P<0.05），并且呈劑量依賴性，4MU濃度越高，其抑制作用越強(qiáng)，見圖1。

2.2 4MU對(duì)KFs遷移能力的影響：如圖2所示，劃痕實(shí)驗(yàn)中KFs的遷移能力被4MU明顯抑制，在0.4mM 4MU條件下，KFs幾乎失去遷移能力。

2.3 4MU對(duì)KFs中α-SMA表達(dá)的影響：免疫熒光結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，4MU（0.4mM）處理組KFs中α-SMA熒光強(qiáng)度明顯降低，見圖3。

2.4 4MU對(duì)透明質(zhì)酸酶表達(dá)及炎癥因子分泌的影響：qPCR結(jié)果表明，4MU可以降低KFs中HAS2和HAS3 mRNA表達(dá)水平（P<0.05），且濃度越高，對(duì)于HAS2的抑制作用越明顯。4MU對(duì)于HAS3的抑制作用與4MU濃度未成明顯的相關(guān)性（見圖4A）。ELISA結(jié)果顯示4MU明顯抑制IL-6和IL-8的分泌（見圖4B），且濃度越高抑制效果越強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣，qPCR結(jié)果表明4MU在mRNA水平抑制IL-6和IL-8的表達(dá)（見圖4C）。

2.5 4MU對(duì)KFs中TLR-4、CD44、NF-κB1及P65產(chǎn)生的影響：采用不同濃度的4MU處理KFs 48h，然后收取KFs進(jìn)行Western-blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4、CD44、NF-κB1及P65表達(dá)的變化。Western-blot分析結(jié)果表明，和未處理組相比，TLR4、CD44、NF-κB1及P65的蛋白表達(dá)量均有所降低（見圖5A）。此外，免疫熒光染色圖片顯示，0.4mM 4MU處理組KFs中NF-κB1和P65的熒光強(qiáng)度比未處理組弱（見圖5B），這與Western-blot結(jié)果相一致。

3? 討論

瘢痕疙瘩是一種復(fù)雜的成纖維細(xì)胞增生性疾病，表現(xiàn)為真皮增厚，ECM合成增多，炎癥因子分泌增加[5]。因此，抑制炎癥反應(yīng)和ECM積聚的方向成為研究者們關(guān)注的重點(diǎn)。HA作為ECM的一種構(gòu)成成分，通過與其他ECM成分的相互作用，在創(chuàng)傷愈合、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[14]。已有文獻(xiàn)報(bào)道HAS2的下調(diào)可抑制瘢痕疙瘩角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[15]。本研究結(jié)果提示，4MU可以下調(diào)HAS2和HAS3基因的表達(dá)，而且對(duì)KFs增殖和遷移能力有明顯抑制作用。此外α-SMA作為細(xì)胞骨架蛋白，是成纖維細(xì)胞收縮表現(xiàn)的標(biāo)志分子，α-SMA已被證實(shí)在瘢痕攣縮過程中起重要作用[16]，而本研究發(fā)現(xiàn)到4MU可以減少α-SMA的表達(dá)。因此4MU對(duì)瘢痕疙瘩形成過程具有潛在的抑制作用。

瘢痕疙瘩網(wǎng)狀層炎性細(xì)胞增多，促炎因子合成增加，促進(jìn)了瘢痕疙瘩的形成[5，17]。尤其是IL-6的表達(dá)水平在瘢痕疙瘩中明顯高于正常皮膚[18]。此外，NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化、存活和增殖的炎癥相關(guān)信號(hào)通路，持續(xù)的NF-κB信號(hào)可引起慢性炎癥，誘導(dǎo)瘢痕疙瘩的形成[17]。本研究結(jié)果表明4MU不僅可以減少KFs中IL-6和IL-8的分泌，還可降低NF-κB1和P65基因表達(dá)水平。這些炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化為4MU抗炎機(jī)制提供了可能的解釋。

CD44和TLR4作為成纖維細(xì)胞表面HA結(jié)合受體，與HA相互作用后可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，參與創(chuàng)面愈合和細(xì)胞侵襲[19-20]。本研究觀察到4MU處理組KFs中TLR4和CD44表達(dá)量降低，因此4MU可能通過抑制HAS2及HAS3轉(zhuǎn)錄，抑制HA合成，進(jìn)而下調(diào)CD44、TLR4的表達(dá)，從而阻斷HA經(jīng)TLR4/CD44介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終起到抑制瘢痕疙瘩的作用。4MU對(duì)瘢痕疙瘩TLR4/CD44-NF-κB信號(hào)通路的影響部分闡明了4MU抑制瘢痕疙瘩炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

但由于目前實(shí)驗(yàn)條件限制，本次僅證明了4MU能抑制KFs中TLR4/CD44-NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。其具體調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探索完善。此外，由于目前缺乏適當(dāng)?shù)鸟：鄹泶駝?dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)研究仍停留在細(xì)胞水平，動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)有待開展。

綜上所述，4MU對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和炎癥均有抑制作用，故4MU作為治療瘢痕疙瘩的藥物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1]閆藝之，姜佳霖，張國(guó)林，等.瘢痕疙瘩的臨床治療最新探索[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2016，25（6）：34-37.

[2]蔡景龍.瘢痕疙瘩的診療指南建議[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2016，25（6）：38-40.

[3]Huang C，Liu L，You Z，et al.Managing keloid scars：From radiation therapy to actual and potential drug deliveries[J].Int Wound J，2019，16（3）：852-859.

[4]王文波，武曉莉，高振.瘢痕疙瘩最新研究進(jìn)展[J].組織工程與重建外科雜志，2018，14（6）：63-66.

[5]Ogawa R.Keloid and hypertrophic scars are the result of chronic inflammation in the reticular dermis[J].Int J Mol Sci，2017，8（3）：606-616.

[6]Paul L Bollyky，Ben A Falk，Rebecca P Wu，et al.Intact extracellular matrix and the maintenance of immune tolerance： high molecular weight hyaluronan promotes persistence of induced CD4+ CD25+ regulatory T cells[J].J Leukoc Biol，2009，86（3）：567-572.

[7]Nadine N，Kuipers HF，F(xiàn)rymoyer AR，et al.4-methylumbelliferone treatment and hyaluronan inhibition as a therapeutic strategy in inflammation，autoimmunity，and cancer[J].Front Immunol，2015，6：123-134.

[8]Davide V，Manuela R，Manuela V，et al.The effects of 4-methylumbelliferone on hyaluronan synthesis， MMP2 activity，proliferation，and motility of human aortic smooth muscle cells[J].Glycobiology，2009，19（5）：537-546.

[9]Nagase H，Kudo D，Suto A，et al.4-methylumbelliferone suppresses hyaluronan synthesis and tumor progression in SCID mice intra-abdominally inoculated with pancreatic cancer cells[J].Pancreas，2017，46（2）：190-197.

[10]Kuipers，HF，Rieck M，Gurevich I，et al.Hyaluronan synthesis is necessary for autoreactive T-cell trafficking， activation， and Th1 polarization[J].Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（5）：1339-1344.

[11]Andre Michael M，Hyung YB， Saud S.Ahmed Inhibition of hyaluronan synthesis protects against central nervous system （CNS） autoimmunity and increases CXCL12 expression in the inflamed CNS[J].J Biol Chem，2014，289（33）：22888-22899.

[12]Yutaka Y，Eiji K，Hiroshi U，et al.Suppression of hyaluronan synthesis alleviates inflammatory responses in murine arthritis and in human rheumatoid synovial fibroblasts[J].Arthritis Rheum，2013，65（5）：1160-1170.

[13]Nadine N，Gernot K，Johnson PY，et al.Inhibition of hyaluronan synthesis restores immune tolerance during autoimmune insulitis[J].J Clin Invest，2015，125（10）：3928-3940.

[14]Jiang D，Liang J， Noble PW.Hyaluronan as an immune regulator in human diseases[J].Physiol Rev，2011，91（1）：221-264.

[15]Supp DM，Hahn IM，McFarland KL，et al.Inhibition of hyaluronan synthase 2 reduces the abnormal migration rate of keloid keratinocytes[J].J Burn Care Res，2014，35（1）：84-92.

[16]Tomasek JJ，Gabbiani G，Hinz B，et al.Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（5）：349-363.

[17]Messadi DV，Doung HS，Zhang Q，et al.Activation of NFkappaB signal pathways in keloid fibroblasts[J].Arch Dermatol Res，2004，296（3）：125-133.

[18]Ghazizadeh M，Tosa M，Shimizu M，et al.Functional implications of the IL-6 signaling pathway in keloid pathogenesis[J].J Invest Dermatol，2007，127（1）：98-105.

[19]Campo GM，Angela A，Salvatore C，et al.Small hyaluronan oligosaccharides induce inflammation by engaging both toll-like-4 and CD44 receptors in human chondrocytes[J].Biochem Pharmacol，2010，80（4）：480-490.

[20]Stavros G， Zhuowei L，Potts EN，et al.TLR4 is necessary for hyaluronan-mediated airway hyperresponsiveness after ozone inhalation[J].Am J Respir Crit Care Med，2010，181（7）：666-675.

[收稿日期]2019-11-06

本文引用格式：牛星堂，林珣珣，朱昭煒，等.4-甲基傘形酮對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的抗炎作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（7）：97-100.