盧紅芳,石向軍,胡陽陽,王晨陽,王家瑞,劉衛(wèi)星,馬 耕,康 娟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,國家小麥工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450046; 2.河南省林州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,河南林州 456550)

淀粉是小麥籽粒的主要貯藏物質(zhì)，對小麥產(chǎn)量形成有重要作用。淀粉的合成與積累由一系列淀粉合成相關(guān)酶協(xié)同參與調(diào)節(jié)。小麥籽粒中，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成的關(guān)鍵酶和限速酶，包括5種同工酶：AGPS1-a,AGPS1-a,AGPS2, AGPL1和AGPL2；結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)有2種同工酶：GBSSI和GBSSII；可溶性淀粉合成酶(SSS)包括7種同工酶：SSI、SSIIa、SSIIb、SSIIc、SSIIIa、SSIIIb和 SSIV；淀粉分支酶(SBE)有4種同工酶：BEI、BEIIa、BEII和BEIII；淀粉去分支酶(DBE)有3種同工酶：ISA1、ISA2和PUL；淀粉磷酸化酶(PHO)主要與淀粉的降解有關(guān)，有2個同工酶：PHOL和PHOH；小麥籽粒淀粉合成主要受以上23個同工酶相應(yīng)基因的協(xié)同表達作用調(diào)控[1]。

小麥籽粒淀粉合成與積累由一系列的生理、生化過程控制，受小麥遺傳特性及生長環(huán)境的雙重影響。水分和溫度作為影響小麥生長發(fā)育的重要因素，對小麥籽粒淀粉合成有重要影響。高溫脅迫可以抑制小麥中AGPase、SSS、GBSS和SBE的表達[2-4]，但其對大部分淀粉合成相關(guān)酶基因表達特性的影響還不清楚，例如對SSIIb、SSIIc、SSIIIb、SSIV、BEIIb、BEIII、GBSSII、ISAI、ISA2、PUL、PHOH、PHOL等[5]。有研究指出，在干旱條件下，水稻中GBSSI的表達量降幅不大，但直鏈淀粉的含量和直/支比顯著降低[6]。有關(guān)干旱脅迫下小麥籽粒中淀粉合成酶基因表達的研究鮮有報道。

有關(guān)開花后短暫高溫、干旱單因素脅迫對小麥籽粒灌漿和品質(zhì)的影響已有較多研究[2,7-8]。小麥實際生產(chǎn)中，高溫和干旱往往同時發(fā)生?；ê蟛煌瑫r期遇到極端高溫(35 ℃以上)和干旱雙重脅迫時，會導(dǎo)致小麥籽粒灌漿期縮短，籽粒直、支鏈淀粉和總淀粉含量降低，籽粒蛋白質(zhì)積累量和粒重下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)量降低[9-11]。但有關(guān)高溫與干旱對小麥籽粒淀粉合成與積累影響的機理研究還很少。本研究擬采用盆栽方式于灌漿期在人工氣候室模擬高溫與干旱脅迫，研究小麥籽粒淀粉合成關(guān)鍵酶相應(yīng)基因的表達及淀粉含量的變化，以探討高溫與干旱脅迫對小麥籽粒淀粉形成的影響機理，為小麥抗逆栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

供試材料為高產(chǎn)強筋小麥品種鄭麥366。

試驗于2016—2017年度在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教試驗園區(qū)，采用大田盆栽與人工氣候室結(jié)合方式進行。

盆栽試驗用土為耕層土壤(pH 8.0)，含有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷和速效鉀分別為18.3 g·kg-1、1.4 g·kg-1、57 mg·kg-1、68 mg·kg-1和204 mg·kg-1，田間持水量為 26.4%。試驗用盆高27 cm、盆口直徑24 cm，每盆裝土10 kg。播種前每盆施純氮1.15 g、P2O51.35 g 和K2O 1.15 g。三葉期定苗，每盆12株。拔節(jié)期結(jié)合澆水，每盆追施純氮1.15 g。

開花期選擇同一天開花、大小均勻的麥穗掛牌標(biāo)記。于開花后第10天，將長勢均勻一致的供試盆栽轉(zhuǎn)移至人工氣候室進行不同處理直至小麥成熟。人工氣候室光照時間為每天8:00-18:00，光照強度為500 μmol·m-2·s-1，自動控溫控濕，相對濕度控制在40%～60%范圍內(nèi)。設(shè)置適溫(25 ℃/15 ℃)和高溫(32 ℃/22 ℃)兩種溫度模式，每種溫度模式下同時設(shè)正常水分處理(土壤相對含水量75%)和干旱處理(土壤相對含水量50%)，組成4個處理，即對照(CK)、干旱(DS)、高溫(HT)和高溫干旱復(fù)合脅迫(HT+DS)，每個處理15 盆。干旱處理自高溫處理前 7 d開始控制澆水，采用稱重法與土壤水分測定儀TDR300相結(jié)合的方法測定土壤含水量，確保高溫處理時達到目標(biāo)含水量。

高溫處理前取樣一次，之后每4 d 取一次樣，直至小麥成熟。一部分籽粒樣品于105 ℃殺青20 min，70 ℃烘至恒重,用高速萬能粉碎機磨粉，用以測定淀粉含量。另一部分樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于提取RNA以測定淀粉合成相關(guān)酶基因表達量。成熟期考種，并測定成熟期淀粉含量。

1.2 淀粉合成相關(guān)酶基因表達量測定

總RNA提取采用TaKaRa試劑盒并按照說明進行。cDNA的合成采用TaKaRa公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照操作說明進行。反轉(zhuǎn)錄于37 ℃恒溫15 min，85 ℃滅活5 s。所合成的 cDNA置于-20 ℃保存。

利用primer 5.0軟件設(shè)計淀粉合成相關(guān)酶基因引物(表1)，由北京華大基因有限公司合成。小麥β-actin基因(GeneBank accession number AB181991)作為內(nèi)參基因。每對引物的擴增產(chǎn)物都要被克隆和測序確保引物的特異性。內(nèi)參基因引物：5′-AAACGAAGGATAGCATGAGGAAG C-3′(正向引物),5′-AGCGGTCGAACAACTG GTA-3′(反向引物)。

表1 測定基因及其引物

采取實時熒光定量PCR參照 StepOnePlusTM.Real-Time PCR System試劑盒說明進行擴增。應(yīng)用ABI PRISM@7300型熒光定量PCR儀，使用兩步法PCR反應(yīng)程序。采用2-ΔΔCt法計算各基因相關(guān)表達量。

1.3 淀粉含量測定

采用雙波長法[12]測定小麥籽粒直鏈、支鏈淀粉含量,兩者之和為總淀粉含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫與干旱對小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因表達的影響

2.1.1 對AGPase同工酶基因表達的影響

如圖1所示，隨時間推移，對照(CK)條件下的5個被測AGPase同工酶基因的表達均呈單峰曲線變化趨勢，于花后14 d達到峰值，之后快速下降。高溫(HT)條件下，AGPS1-b、AGPS2、AGPL2表達趨勢與對照一致，而AGPL1、AGPS1-a呈持續(xù)下降趨勢。干旱(DS)條件下，AGPL1、AGPL2、AGPS1-a和AGPS1-b的表達趨勢與對照基本一致，其中，AGPS1-b的峰值推遲到至花后18 d出現(xiàn)，而AGPS2整體呈下降趨勢。高溫與干旱脅迫(HT+DS)處理下，AGPL1、AGPL1、AGPS2表達呈下降趨勢，而AGPS1-a和AGPS1-b表達趨勢與CK一致。HT+DS處理下不同AGPase同工酶基因的表達趨勢與單因素脅迫處理不完全一致，推測兩者之間存在互作效應(yīng)。與對照比較，DS處理使AGPL1、AGPS1-a和AGPS1-b的相對表達量提高，而使AGPL2和AGPS2表達量下降；HT和HT+DS使AGPase的5個同工酶基因表達量均下降。

圖1 不同處理AGPase同工酶基因表達的變化

2.1.2 對GBSS同工酶基因表達的影響

GBSS主要是參與直鏈淀粉合成的酶，有GBSSI和GBSSII兩個同工酶基因。GBSSI在直鏈淀粉合成中起主要作用。

如圖2所示，除HT+DS外，其他處理下GBSSI的相對表達量呈單峰曲線變化趨勢，在花后22 d達到峰值，之后迅速下降，至灌漿后期趨于平穩(wěn)。HT+DS處理下GBSSI的相對表達量整體呈下降趨勢。CK和DS處理下，GBSSII的相對表達量整體呈雙峰曲線變化趨勢，分別在花后14 d和26 d出現(xiàn)峰值，DS處理GBSSII的表達量整體較高。HT處理GBSSII的相對表達量整體呈下降的趨勢，且明顯低于其他處理。HT+DS下，GBSSII的表達量在花后22 d之前與CK差異較小，且在大多時間高于CK，22 d之后開始急速下降，至花后26 d時明顯低于CK。

圖2 不同處理GBSS同工酶基因表達的變化

2.1.3 對SSS同工酶基因表達的影響

如圖3，對SSI來說，CK、DS、HT及其復(fù)合脅迫處理的相對表達量均呈單峰曲線變化，于花后14 d達最大值。較對照而言，DS提高了SSI基因的相對表達量(花后30 d除外)，平均是對照的1.26倍；HT降低了SSI的相對表達量，平均比對照減少21.22%?；ê?0～18 d，HT+DS處理的SSI相對表達量高于對照，之后迅速下降低于對照。CK和DS處理的SSIIa和SSIIIa表達量表現(xiàn)為單峰曲線，DS處理一定程度上提高了這兩個基因的表達量；而HT和HT+DS均導(dǎo)致SSIIa和SSIIIa表達量下降。不同處理的SSIIb和SSIV表達亦呈現(xiàn)單峰曲線，在花后 22～30 d分別出現(xiàn)最大表達量，HT+DS處理時表達量峰值出現(xiàn)時間比對照提前了4～8 d，且峰值降低；DS、HT和HT+DS處理基因表達量在峰值出現(xiàn)之前高于對照，之后迅速下降，低于對照。花后10～26 d，DS處理SSIIIb相對表達量高于CK，之后迅速下降，低于CK；高溫降低了SSIIIb相對表達量，其中HT+DS下降幅度最大，體現(xiàn)出高溫與干旱雙重脅迫的疊加效應(yīng)。DS整體上提高了SSIIc的相對表達量，而HT導(dǎo)致不同時期SSIIc表達量下降，HT+DS處理花后22 d開始才低于對照。

圖3 不同處理SSS同工酶基因表達的變化

2.1.4 對SBE同工酶基因的影響

如圖4，BEI的相對表達量呈單峰曲線變化趨勢，DS提高不同時期BEI的表達量；而HT處理于峰值前提高其表達量，之后使其迅速下降至低于對照。DS處理對BEIIa的影響較小，提高了不同時期BEIIb的表達量；HT處理降低了BEIIa和BEIIb的相對表達量。BEIII表達亦呈單峰曲線，DS、HT和HT+DS分別使表達量峰值出現(xiàn)時間比對照提前8 d、4 d和8 d，在峰值出現(xiàn)之前，脅迫處理提高了其表達量，之后使其迅速下降至低于對照。

圖4 不同處理SBE同工酶基因表達的變化

2.1.5 對DBE同工酶基因的影響

如圖5所示，HT與DS條件下，ISA1相對表達量均低于對照。HT處理降低了ISA2的表達量，而DS和HT+DS處理的ISA2基因表達量高于CK。DS處理提高PUL相對表達量，HT提高了脅迫初期(花后10～18 d)PUL表達量，而之后降低其表達量。

圖5 不同處理籽粒DBE同工酶基因表達的變化

2.1.6 對PHO同工酶基因的影響

如圖6，HT與DS條件下，PHOL的相對表達量下降。PHOH表達量呈現(xiàn)單峰曲線變化趨勢，HT與DS處理峰值出現(xiàn)時間比CK提前4 d，HT和HT+DS在峰值出現(xiàn)之前高于CK，之后迅速下降至低于CK，DS整體上提高了PHOH相對表達量。

圖6 不同處理籽粒PHO同工酶基因表達的變化

2.2 高溫與干旱對小麥籽粒淀粉及其組分含量的影響

HT和DS處理均顯著降低了成熟期小麥籽粒直鏈、支鏈和總淀粉含量(表2)。與CK相比，DS、HT和HT+DS處理下直鏈淀粉含量分別下降4.2%、10.2%和14.9%，支鏈淀粉含量分別下降6.0%、13.4%和18.7%，總淀粉含量分別下降 5.6%、12.7%和17.8%。HT與DS條件下，支鏈淀粉下降幅度較大，導(dǎo)致直/支比值升高，DS、HT和HT+DS處理較CK分別升高1.9%、3.7%和4.6%。不同處理間比較，HT對淀粉含量的影響大于DS，HT+DS脅迫的影響大于單一因子脅迫，表現(xiàn)出顯著的疊加效應(yīng)。

表2 不同處理成熟期小麥籽粒淀粉及其組分含量的差異

2.3 小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因表達與支、直鏈淀粉和總淀粉含量的相關(guān)性

小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因表達與淀粉及其組分含量關(guān)系密切。在大部分測定時期，被測基因表達量與支鏈淀粉和總淀粉含量顯著或極顯著相關(guān)(表3)。如AGPS1-a、SSIIIa表達量與支鏈淀粉和總淀分含量顯著或極顯著相關(guān)(除花后22 d)；AGPS1-b、AGPL2表達量與支鏈淀粉和總淀粉含量顯著或極顯著相關(guān)(除花后14 d)；SSIIIb表達量與支鏈淀粉和總淀分含量均顯著或極顯著相關(guān)；BEI、BEIIa表達量與支、直鏈及總淀粉含量顯著或極顯著相關(guān)(除花后22 d與直鏈淀粉不顯著)?？偟膩碚f，基因表達量與支鏈淀粉和總淀粉含量的關(guān)系比直鏈淀粉更密切。

表3 淀粉合成相關(guān)酶基因表達量與支、直鏈淀粉和總淀粉含量的相關(guān)分析

3 討 論

小麥籽粒灌漿階段的適宜溫度為20～24 ℃，超過30 ℃的高溫會使淀粉含量下降[13-14]。關(guān)于高溫脅迫下籽粒淀粉合成酶基因表達的研究報道較少，尤其是高溫與干旱復(fù)合脅迫條件下，有關(guān)全部淀粉合成相關(guān)酶基因表達的研究鮮有報道。有研究表明，GBSSI、AGPase1、SSIII和SBEI的表達量在花后12～18 d達到峰值[15-16]，高溫會降低AGPase、SSS、GBSS和SBE的轉(zhuǎn)錄水平[3]，高溫(35 ℃，花后5～7 d)使淀粉合成相關(guān)酶基因AGPS1-a、GBSSI、SSSIIIa、SBEI的表達量降低[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫導(dǎo)致不同時期或脅迫后期的23個淀粉合成相關(guān)酶基因表達量不同程度的降低。高溫條件下，AGPS1、AGPS2、AGPL1、AGPL2、GBSSI、SSI、SSIIa、SSIIIb、SBEI和SBEIIa下調(diào)表達，此結(jié)果與先前的研究一致[3,5]。有研究表明，AGPase、SSS和SBE可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控籽粒淀粉的合成，而GBSSI則在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本試驗條件下，高溫抑制GBSS的表達，干旱提高GBSSI表達，而高溫與干旱對直鏈淀粉的影響很小。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，高溫與干旱條件下，小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因表達模式發(fā)生變化，例如，SSIIa和BEIIa在對照中呈單峰曲線變化趨勢，在高溫處理中則呈整體下降趨勢；高溫與干旱處理中SSIIb、SSIV、BEIII表達量峰值出現(xiàn)時間比對照提前4～8 d，且峰值有不同程度下降。說明高溫與干旱加快了淀粉合成相關(guān)酶基因的表達速率，但降低了其表達量，導(dǎo)致淀粉積累時間縮短、積累量的減少。高溫與干旱均導(dǎo)致成熟期籽粒直鏈、支鏈和總淀粉含量下降，對支鏈淀粉的影響比直鏈淀粉大。小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因表達與支鏈和總淀粉含量關(guān)系密切。高溫與干旱脅迫主要影響支鏈淀粉的合成與積累，對直鏈淀粉的影響較小。高溫與干旱改變小麥籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因表達是小麥籽粒淀粉積累受抑的主要原因，最終導(dǎo)致籽粒淀粉含量及產(chǎn)量下降。