高 天，徐夢軍，李鴿子，康國章,2

(1.河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學國家小麥工程技術研究中心，河南鄭州 450002)

高等植物在長期進化過程中形成了一個復雜的網絡系統以調控逆境脅迫和物質合成。AP2/ERF類轉錄因子約由60個氨基酸殘基組成，包含1個α-螺旋和3個反向平行β-折疊的DNA保守結構域，β-折疊可與順式作用元件發(fā)生特異性結合，調控基因表達[1]。研究表明，AP2/ERF類家族轉錄因子參與了花器官發(fā)育、非生物及生物脅迫和物質合成等過程[2-4]。

淀粉是小麥籽粒最主要的組分，約占籽粒干重的65%～80%，其含量是小麥產量的決定因素。目前已開展了大量有關淀粉合成相關酶基因的表達和功能研究[5]，但有關控制這些酶基因表達的分子調控網絡尚未建立[6]。Wang等[7]發(fā)現，水稻OsbZIP58轉錄因子與COsAGPL3、OsGBSSI(Wx)、OsSSIIa、OsSBE1、OsBEIIb和OsISA2的啟動子相結合，調控水稻籽粒淀粉的合成；Zhang等[8]、Chen等[9]、Huang等[11]研究發(fā)現，玉米轉錄因子ZmaNAC36、ZmbZIP91和ZmEREB156可調控多個淀粉合成相關基因的表達；Li等[11]發(fā)現，ERF類轉錄因子ZmEREB94調控玉米籽粒淀粉合成相關基因的表達，參與玉米淀粉的合成。Liu等[4]發(fā)現，AP2/EREBP轉錄因子TaRSR1通過負向調控小麥籽粒淀粉合成相關基因的表達，影響了籽粒淀粉合成。

本課題組前期研究表明，TaERFL1a轉錄因子參與小麥響應干旱、冷害等非生物脅迫調控[12-13]，但該轉錄因子是否參與小麥籽粒淀粉合成尚不清楚。本研究在田間生長條件下采用BSMV-VIGS技術，以探究TaERFL1a轉錄因子在小麥籽粒淀粉合成中的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種百農207由河南科技學院歐行奇教授提供，2016年10月12日在河南農業(yè)大學科教示范園區(qū)(鄭州，34°92′ N,112°99′ E)種植，按照常規(guī)高產田進行種植管理。載體BSMV-α、-β和-γ由中國科學院遺傳與發(fā)育生物研究所王道文研究員饋贈。

MulⅠ、SpeⅠ、BssHⅡ、PacⅠ和NotⅠ等限制性內切酶購自NEB公司；2×Taq Plus Master Mix購于Vazyme公司；T載體、T4 DNA ligase連接酶、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、qRT-PCR熒光定量反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,Prefect Real Time)購自TaKaRa公司；體外轉錄試劑盒(RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7)和Ribo m7G Cap Analog購于Promega公司；Trizol購自于鼎國生物有限公司；0.08 mm PVC薄膜購于上海恩爾塑業(yè)有限公司。

用Primer 5.0設計PCR引物，引物合成和基因測序均由北京六合華大基因公司完成。

1.2 BSMV-VIGS載體的構建和病毒的產生

選取TaERFL1a基因CDS中非AP2/ERF保守域，但在ABD 3個拷貝同源性較高(98.4%)的一段序列，同時沉默3個拷貝而不影響其它家族成員(圖1)，片段長239 bp，用特異性引物擴增，構建BSMV-VIGS-TaERFL1a重組載體。引物序列為：5′-CCTTAATTAAGCGGCGGCAT GCG-3′(PacI)和5′-TATGCGGCCGCCAAC GACCGACGAG-3′(NotI)，擴增產物純化后連入T載體(TaERFL1a-T)并測序驗證。用PacI和NotI限制性內切酶分別酶切BSMV-γ和TaERFL1a-T載體，片段純化回收后以T4連接酶連接，構建BSMV-VIGS-TaERFL1a沉默載體，酶切并測序驗證，載體構建過程參考Ma等[14]的方法。以沉默報告基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)載體(BSMV-VIGS-GFP)為對照[4]。

虛線表示AP2/ERF保守結構域，實線表示用于VIGS沉默片段。

將BSMV-α、BSMV-β、BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP分別用限制性內切酶MulⅠ、SpeⅠ和BssHⅡ進行充分酶切線性化，純化線性化產物用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7體外轉錄試劑盒進行體外轉錄，將轉錄得到的RNA進行檢測，-80 ℃保存，接種前在冰上將體外轉錄的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-VIGS-TaERFL1a或BSMV-VIGS-GFP等比例混合，用DEPC處理水稀釋1倍，按照每2.5 μL混合液與45 μL FES緩沖液的比例混合生產BSMV病毒，用于田間摩擦接種。

1.3 TaERFL1a基因沉默小麥植株的獲得

在小麥抽穗期選取生長狀態(tài)一致的小區(qū)，構建塑料拱棚(2.9 m寬×5 m長×1.7 m拱高)。在小麥抽穗期(2017年4月17日)選擇生長一致的50個主莖穗。接種的前1 d，塑料拱棚覆蓋PVC透明薄膜，保持適宜溫度和較高的濕度。病毒接種部位為小麥即將開花的穗部，取20 μL混合物點加在戴有乳膠手套的食指上，與拇指輕輕接觸，從穗基部直至穗尖摩擦接種，另一只手扶好第二穗基部，防止扯斷穗。接種后噴少許DEPC處理水，用保鮮膜包裹保溫保濕，1 d后取掉保鮮膜；同時，大棚覆蓋PVC薄膜，提高接種率。在接種后15 d開始每天觀察穗部以及穎殼是否出現病毒表型。

1.4 TaERFL1a基因沉默小麥籽粒鑒定

接種后23 d出現明顯病毒表型，分別取BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP浸染后有病毒表型的穗部籽粒，立即放入液氮速凍。采用Trizol法提取籽?？俁NA，參照qRT-PCR反轉錄試劑盒說明書的方法，檢測TaERFL1a基因轉錄水平。TaERFL1a基因的定量引物序列為：5′-GCCAAGGACCTCGTTAGAAAG A-3′和5′-GGCCCGTTCAGATCCAGAT-3′，擴增片段長度為 154 bp。分別以Actin(GenBank accession No.AB181991)和GAPDH(GenBank accession No.EU022331)為內參基因，Actin引物序列為:5′-AGCGGTCGAACAACTGGTA-3′和5′-AAACGAAGGATAGCATGAGGAAGC-3′，片段擴增長度為101 bp；GAPDH引物序列為: 5′-TTTTCACCGACAAGGACA-3′和5′-AAGAGGAGCAAGGCAGTT-3′，片段擴增長度為179 bp。TaERFL1a基因表達水平用2-ΔΔCt法進行計算，各樣品均進行3次生物學重復，以三次生物學重復均值表示最終結果。用統計學軟件SPSS 17.0分析數據顯著性。

接種后23 d、26 d、30 d和35 d，分別取小麥穗部及穗中部籽粒的表型進行鑒定。小麥成熟后，收獲TaERFL1a基因沉默和對照小麥的成熟籽粒，隨機取部分籽粒用于籽粒形態(tài)及淀粉相關指標的測定。采用雙波長法測定基因沉默植株和對照植株籽粒中淀粉含量[15]。另選取60粒種子，每10粒為一組，對籽粒的長度和寬度進行測定。通過計算3組百粒重來評價籽粒的千粒重。以上所有數據均進行3次生物學重復，用SPSS 17.0分析數據顯著性。以BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP沉默小麥中的成熟籽粒為材料，橫向切割后，用導電膠帶固定，離子濺射儀(HITACHIE-1010，日本)噴金后，在掃描電鏡(HITACHI S-3400N-Ⅱ,日本)下拍照，觀察小麥胚乳淀粉粒形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 TaERFL1a基因沉默植株的獲得

將BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP病毒分別接種在即將開花的小麥穗部。接種23 d后，穗部和穗下節(jié)均出現大麥條紋花葉病病毒表型(圖2A)，表明病毒已成功感染麥穗。用qPCR檢測了接種后23 d穗部有病毒表型的籽粒中TaERFL1a基因的表達量，結果顯示，接種BSMV-VIGS-TaERFL1a植株的籽粒，TaERFL1a的表達量顯著低于對照植株，降幅為 67.3%～ 93.4%(圖2B和C)，表明接種BSMV-VIGS-TaERFL1a病毒的籽粒內TaERFL1a基因的表達被顯著抑制，獲得TaERFL1a基因沉默的小麥植株。

2A中1、2和3分別表示未接種小麥穗、接種BSMV-VIGS-GFP和接種BSMV-VIGS- TaERFL1a的小麥穗部；2B和2C分別表示用Actin和GAPDH為內參基因對 TaERFL1a轉錄水平的計算結果。*表示接種BSMV-VIGS-GFP與接種BSMV-VIGS- TaERFL1a的差異達到顯著水平(P<0.05)。

2.2 TaERFL1a在小麥籽粒淀粉合成中的功能

與接種BSMV-VIGS-GFP植株相比，接種BSMV-VIGS-TaERFL1a的小麥植株的穗部表型沒有顯著的變化，但TaERFL1a基因沉默植株成熟籽粒偏小，充實度低，籽粒干癟(圖3)。定量測定結果表明，接種BSMV-VIGS-TaERFL1a的小麥成熟籽粒的粒長、粒寬、千粒重和淀粉含量均顯著降低，分別降低了5.22%、12.70%、9.53%和5.43%(表1)。

表1 接種BSMV-VIGS-GFP和BSMV-VIGS- TaERFL1a小麥植株的成熟籽粒和淀粉性狀

dpi：病毒接種小麥穗部后的天數。

電鏡掃描結果顯示，TaERFL1a基因沉默植株籽粒和對照小麥籽粒胚乳中淀粉粒存在較大差異。TaERFL1a基因沉默植株籽粒中胚乳大顆粒的A型淀粉數目與對照無明顯差異，淀粉粒排列松散，但小顆粒的B型淀粉數目顯著減少(圖4)，表明TaERFL1a可能通過影響B(tài)型淀粉粒的形成而影響淀粉的合成。

圖4 接種病毒植株成熟籽粒胚乳掃描電鏡的觀察結果

3 討 論

黃淮地區(qū)是我國冬小麥的主產區(qū)，該區(qū)冬小麥分蘗基本能夠滿足成穗數需求，且多花多粒的優(yōu)勢明顯，有利于形成大穗多粒，但由于該區(qū)小麥灌漿期常出現不利天氣，導致灌漿期較短(35 d左右)，使許多小麥品種高粒重潛力難以得到充分發(fā)揮，因而制約了產量的進一步提高[16]。目前，黃淮地區(qū)大面積推廣的小麥品種的千粒重潛力大多在48 g以上，但在實際生產中，這些品種的千粒重常年在42 g以下，飽滿度較差，因此，僅粒重這一個指標，這些品種增產潛力可達900 kg·hm-2以上(以千粒重增加1 g，每公頃增加150 kg計算)。淀粉是小麥籽粒最重要的組分，因此，提高粒重主要在于提高籽粒淀粉的合成能力。

轉錄因子是生物信號轉導途徑中重要成員，它能與一個或數個功能基因的啟動子相結合，從而調控下游一系列基因的表達，比調控單一功能基因能獲得更好的效果，因此成為近年來研究的熱點[17]。作物籽粒淀粉相關研究主要集中在功能基因方面，而對調控功能基因表達的轉錄因子報道較少，且集中在水稻和玉米方面[17]。本研究結果顯示，抑制TaERFL1a轉錄因子表達后，小麥籽粒的粒長、粒寬和千粒重均顯著降低，表明TaERFL1a轉錄因子影響小麥籽粒的粒重。進一步研究發(fā)現，TaERFL1a基因沉默植株籽粒淀粉含量顯著降低，表明抑制該基因的表達能顯著影響淀粉的合成；電鏡觀察結果顯示，TaERFL1a可能通過影響籽粒中B型淀粉粒的形成參與了淀粉的合成，進而影響了粒重。已有研究發(fā)現，水稻中OsbZIP58轉錄因子能夠結合SBE1的啟動子，通過調控SBE1表達參與淀粉的合成[7]；玉米中ZmbZIP91轉錄因子直接結合AGPS1、SSI、SSIIIa和ISA1基因上游啟動子特異元件，調控其表達，影響玉米淀粉的合成[9]；小麥中ERF轉錄因子通過特異結合靶基因啟動子區(qū)域的GCC-box或DRE/CRT元件來調控下游靶基因的表達[18]。因此，推測本研究中小麥TaERFL1a轉錄因子可能與淀粉合成相關基因啟動子序列上的特異性順式作用元件相結合，從而調控了它們的表達，參與了小麥籽粒淀粉合成。