羊 陽，丁夢云，郭 雷，李慧敏，李少鵬，仝靖洋，王中華，高 欣

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

普通小麥(TriticumaestivumL.)作為世界上分布最廣泛、最重要的糧食作物之一，因其獨(dú)特的面筋結(jié)構(gòu)而具有較強(qiáng)的可加工性，被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)。小麥麥谷蛋白是面筋的骨架成分，根據(jù)其分子量的大小被分為高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)，其中HMW-GS僅占普通小麥總麥谷蛋白的7%～15%，但解釋了面筋、面團(tuán)和小麥加工品質(zhì)特性變異的45%～70%[1]，是影響小麥面制品品質(zhì)的關(guān)鍵因素。HMW-GS的組成和含量對小麥面團(tuán)的加工品質(zhì)有顯著影響[2]。在亞基組成方面，一般認(rèn)為5+10、17+18等為優(yōu)質(zhì)亞基組合，而2+10、5+12、2+12為劣質(zhì)亞基組合；在含量方面，HMW-GS含量較高的小麥面團(tuán)表現(xiàn)出更好的加工品質(zhì)和烘培品質(zhì)。我國當(dāng)前小麥育種工作中，小麥主產(chǎn)區(qū)都存在著由于優(yōu)質(zhì)親本源單一導(dǎo)致新品種遺傳相似性高、育成突破性品種難度加大的問題，尤其在品質(zhì)育種方面[3]。挖掘新型優(yōu)質(zhì)的HMW-GS資源，對小麥品質(zhì)改良具有重要意義，也是當(dāng)前小麥育種研究的熱點(diǎn)。

小麥的近緣屬種中存在著許多對小麥品種改良有著重要作用的基因，利用遠(yuǎn)緣雜交和分子生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)制小麥近緣屬種與小麥異附加系已經(jīng)成為小麥品種改良的重要方法[4-5]。有研究利用小麥-黑麥異附加系發(fā)現(xiàn)并定位了來自于黑麥染色體的抗旱基因[6]。Olson等[7]利用遠(yuǎn)緣雜交獲得了抗條銹病的小麥-粗山羊草異附加系。目前，利用小麥近緣屬種的優(yōu)質(zhì)基因已經(jīng)創(chuàng)建了包括山羊草、水草、類麥、偃麥草、賴草、鵝觀草、大麥、黑麥、冰草等34種屬小麥近緣植物200多個異附加系，極大豐富了小麥育種種質(zhì)資源[8]。

卵穗山羊草(Aegilopsgeniculata，2n=4x=28，UgUgMgMg)是普通小麥的一個近緣種屬，其在抗蟲、抗病、抗逆等方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的特性。已有研究證明，卵穗山羊草對菲利普孢囊線蟲存在抗性，并具有一定的抗旱性；其所攜帶的抗白粉病基因具有可遺傳性并在后代中能良好表達(dá)[9-11]。

小麥近緣屬種中存在優(yōu)質(zhì)HMW-GS的編碼基因，對改善小麥面團(tuán)的品質(zhì)有顯著作用[12-14]。但利用卵穗山羊草進(jìn)行品質(zhì)改良的研究較少。本研究擬以中國春(CS)為對照，解析CS-卵穗山羊草1Mg異附加系(CS-1Mg)面團(tuán)的品質(zhì)特性，為豐富小麥種質(zhì)資源、進(jìn)一步促進(jìn)小麥品質(zhì)改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為中國春(CS)以及以中國春為背景的小麥-卵穗山羊草1Mg異附加系(CS-1Mg，染色體組成2n=44)。材料于2017-2018年種植于中國陜西省楊陵區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)作物教學(xué)標(biāo)本區(qū)(108°4′E，34°16′N)。每個小區(qū)種植6行，行長為2 m，行距為0.25 m，株距為0.05 m。設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 麥谷蛋白的分離

參考Gao等[15]的方法，利用4%的上層濃縮膠和10%的下層分離膠建立連續(xù)的SDS-PAGE分離體系。參考Li等[16]方法，使用高效液相色譜儀(1260,Agilent,USA)對供試材料的HMW-GS進(jìn)行RP-HPLC精細(xì)分離，并利用Agilent對液相圖譜的峰面積進(jìn)行手動積分，計(jì)算各HMW-GS的表達(dá)量。

1.2.2 籽粒發(fā)育過程中谷蛋白聚合體積累的動態(tài)檢測

利用排阻-高效液相色譜測定開花后籽粒發(fā)育不同時(shí)期(花后4 d、7 d、13 d、16 d、21 d、26 d、31 d和成熟)SDS不溶性谷蛋白聚合體(UPP)和SDS可溶性谷蛋白聚合體(EPP)的含量。UPP與EPP的提取參考Zhao等[17]的方法。UPP占比(%)=UPP的峰面積/(UPP+EPP)峰面積×100%，以不同時(shí)期的UPP占比表示籽粒發(fā)育過程中谷蛋白聚合體的動態(tài)變化。

1.2.3 面筋樣品的制備

供試材料的面筋樣品參考Gao等[18]的方法通過手洗法得到。得到的面筋樣品被分為兩份，一份直接用于微觀結(jié)構(gòu)的觀察，另一份在超低溫冷凍干燥機(jī)(GWSP,Jiwei,Shanghai,China)下凍干48 h后研磨成粉，用于二級結(jié)構(gòu)的測定。

1.2.4 面筋樣品二級結(jié)構(gòu)的測定

利用傅里葉紅外變換光譜儀(Vetex70,Bruker Optics,Germany)測定供試材料面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)。測定其在1 600～1 700 nm波段的吸光度，測得的光譜圖像用Peakfit(PeakFit v4.12,SeaSolve Software Inc.USA)多峰擬合處理后得到二級結(jié)構(gòu)分布。

1.2.5 面筋樣品微觀結(jié)構(gòu)的觀察及定量分析

參考Li等[19]的方法，利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Scientz-750F,SCIENTZ,Ningbo,China)對面筋樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。掃描電鏡的電壓為15 kV，放大倍數(shù)為2 000倍。

激光共聚焦顯微鏡(CLSM)的觀察方法參考Bernklau等[20]的方法，并稍作修改。利用Olympus IX83 反向電子顯微鏡對樣品進(jìn)行觀測，其自身帶有FLUOVIEW(FV1200)生物激光共聚焦掃描系統(tǒng)并配有LD559半導(dǎo)體激光發(fā)生器和物鏡。分辨率為800×800像素，大小為317 μm×317 μm。

根據(jù)Gao等[15]的方法利用激光共聚焦顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)結(jié)合AngioTool軟件(National Cancer Institute,National Institute of Health,Maryland,USA)對面筋的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過蛋白質(zhì)面積、蛋白質(zhì)面積比率、蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)、節(jié)點(diǎn)密度、蛋白長度、蛋白端點(diǎn)數(shù)、孔隙度、端點(diǎn)率和分支率共9個參數(shù)定量分析兩份供試材料的面筋蛋白結(jié)構(gòu)。

1.2.6 部分籽粒品質(zhì)指標(biāo)測定

利用近紅外谷物分析儀(Diode Array 7250,Perten,Sweden)測定供試材料籽粒的含水量、蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、淀粉含量、沉降值。

1.2.7 面團(tuán)混揉特性的測定

參考Rosell等[21]的方法，利用肖邦混揉儀(Chopin,Tripette and Renaud,France)測定供試樣品的吸水率、面團(tuán)形成時(shí)間與穩(wěn)定時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷蛋白組成分析

2.1.1 谷蛋白亞基的分離和鑒定

從CS與CS-1Mg麥谷蛋白的分離結(jié)果(圖1A)看，兩者的LMW-GS組成未出現(xiàn)明顯差異。在HMW-GS組成方面，與CS相比，CS-1Mg的HMW-GS組成有四個亞基，表現(xiàn)為Dx2亞基缺失，但出現(xiàn)一個未知新亞基(UK)，其余三個HMW-GS亞基與CS一致，推測由于其攜帶了卵穗山羊草1Mg染色體。小麥的HMW-GS雖然只占小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的7%～15%，但是它對小麥面團(tuán)的強(qiáng)度和彈性有著重要作用，新型未知亞基的出現(xiàn)可能影響CS-1Mg的品質(zhì)[22]。利用RP-HPLC對CS與CS-1Mg的HMW-GS進(jìn)行了精細(xì)分離(圖1B)，可以看出，CS-1Mg與CS樣品均含有四個峰，表明兩個樣品分別含有四個亞基，其中三個亞基的出峰時(shí)間相同，推測其為Bx7、By8和Dy12亞基。CS-1Mg含有一個不同于Dx2亞基的一個新亞基，這與SDS-PAGE的結(jié)果相吻合。

圖1 供試材料麥谷蛋白組成的SDS-PAGE和RP-HPLC鑒定

2.1.2 HMW-GS定量分析

HMW-GS組分分布結(jié)果(表1)表明，與CS比較，CS-1Mg中Bx7亞基含量顯著提高，而By8亞基含量略微下降，Dy12亞基含量無明顯變化。CS-1Mg中新型未知亞基含量明顯高于原CS中的Dx2亞基，推測會導(dǎo)致這兩份材料的面團(tuán)特性與功能存在差異。

表1 供試材料HMW-GS的組分分布

2.2 籽粒發(fā)育過程中谷蛋白聚合體動態(tài)積累過程

由圖3可知，CS-1Mg的UPP占比在整個籽粒發(fā)育過程中均高于CS，由于UPP占比與面團(tuán)的強(qiáng)度有明顯的正相關(guān)關(guān)系[23]，推測CS-1Mg的面筋品質(zhì)優(yōu)于CS。在籽粒發(fā)育的初期(4～7 d)UPP迅速積累，CS與CS-1Mg變化趨勢基本相同。在籽粒發(fā)育的中前期(7～10 d)，CS的UPP占比出現(xiàn)明顯下降的趨勢，而CS-1Mg則持續(xù)增加。到籽粒發(fā)育的中期時(shí)(10～16 d)，CS與CS-1Mg的UPP占比均呈增加趨勢，但在CS-1Mg中的增加速率明顯高于CS。在籽粒發(fā)育中后期(16～21 d)，CS與CS-1Mg均出現(xiàn)一段UPP占比的下降期，但CS-1Mg的下降程度較小。接近成熟期時(shí)，兩個材料均有一段UPP快速積累期，但CS-1Mg的快速積累期較短。

圖2 小麥花后不同時(shí)期籽粒的UPP%變化

2.3 面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析

與CS相比，CS-1Mg的面筋蛋白中 α螺旋含量較低，水合β折疊含量較高，其β轉(zhuǎn)角含量顯著提高(P<0.05)，分子間β折疊含量顯著下降(P<0.05)(表2)。面團(tuán)的流變學(xué)特性與水合β折疊、β轉(zhuǎn)角之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系，而與α螺旋、分子間β折疊存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[24]。β折疊和β轉(zhuǎn)角相較于α螺旋有著更好的親水性，能夠更好的結(jié)合面團(tuán)中的水分，形成分子間氫鍵，增加面筋蛋白的穩(wěn)定性和強(qiáng)度，進(jìn)一步提高其流變學(xué)特性[25]。因此，推測CS-1Mg中因?yàn)楹扛叩乃夕抡郫B、β轉(zhuǎn)角使其與CS相比具有更好的水結(jié)合力，同時(shí)含量較低的分子間β折疊使其能更好的破壞蛋白間相互作用，進(jìn)而促進(jìn)面筋蛋白網(wǎng)狀的形成[26]。

表2 兩份材料的面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)

2.4 面筋蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 掃描電鏡結(jié)果分析

相較于CS，CS-1Mg的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)分布更均勻且孔徑較小(圖3)，說明其面筋蛋白具有更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，面筋蛋白分子之間連接的更緊湊，使CS-1Mg在接受外界壓力后能更好的保持其原有的結(jié)構(gòu)，宏觀上表現(xiàn)為流變學(xué)特性的提高。

A:CS面筋在2 000×的掃描圖像；B:CS-1Mg面筋在在2 000×的掃描圖像；標(biāo)尺代表10 μm。

2.4.2 激光共聚焦圖像定量分析

與掃描電鏡結(jié)果相似的是，激光共聚焦圖像(圖4)中，CS-1Mg同樣表現(xiàn)出相較于CS更均勻緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。結(jié)合AngioTool定量分析結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，CS-1Mg與CS相比，蛋白質(zhì)面積略微增加且蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)密度顯著增加(P<0.05)，表明CS-1Mg蛋白含量增加；CS-1Mg的蛋白端點(diǎn)數(shù)和端點(diǎn)率顯著提高(P<0.05)，說明其面筋連接更緊密[21]；CS-1Mg的孔隙度較于CS明顯下降(P<0.05)，這表明了CS-1Mg面筋網(wǎng)絡(luò)分布更均勻。

表3 兩份小麥品系面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)定量分析

CS-1Mg在面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與數(shù)量指標(biāo)上均優(yōu)于CS對照，可歸因于其更優(yōu)質(zhì)的亞基組成和更好的二級結(jié)構(gòu)分布，從而形成了更緊密的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，推測這些變化會直接影響面團(tuán)的混揉特性。

2.5 面團(tuán)混揉特性的分析

利用近紅外谷物分析儀分析CS與CS-1Mg籽粒品質(zhì)特性，結(jié)果表明，與CS對照相比，CS-1Mg的淀粉含量變化不顯著，蛋白質(zhì)、濕面筋含量和沉降值顯著提高(P<0.05)，說明CS-1Mg的籽粒品質(zhì)優(yōu)于CS，結(jié)合上述結(jié)果，可以認(rèn)為其籽粒品質(zhì)的提升是由HMW-GS組成變異導(dǎo)致的。表4表明，與CS對照相比，CS-1Mg面團(tuán)的形成時(shí)間與穩(wěn)定時(shí)間均顯著提高(P<0.05)，形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間與面筋強(qiáng)度存在著顯著正相關(guān)關(guān)系[27]，推測CS-1Mg的面團(tuán)筋力更高，具有更好的加工品質(zhì)。

3 討 論

小麥的HMW-GS只占到小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的7%～15%，但對小麥面團(tuán)的強(qiáng)度和彈性有著重要作用。育種工作者對有關(guān)小麥近源種屬植物中的HMW-GS已有一定研究，如Zahra等[12]發(fā)現(xiàn)，伊朗山羊草中存在豐富的HMW-GS變異；顏澤洪等[13]在粗山羊草中發(fā)現(xiàn)了兩種新型HMW-GS。但大部分研究往往只停留在對新型亞基的篩選上，沒有對新型亞基對于品質(zhì)可能出現(xiàn)的提升進(jìn)行系統(tǒng)的分析和研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在亞基組成方面，CS-1Mg中出現(xiàn)的新型HMW-GS替換了CS中的Dx2型亞基，打破了2+12的劣質(zhì)亞基組成，使得其亞基組成優(yōu)于CS。這可能是由于材料創(chuàng)制過程中卵穗山羊草1Mg染色體上基因的表達(dá)或發(fā)生了DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾使得Dx2基因沉默導(dǎo)致的[28]。在小麥籽粒的發(fā)育過程中，HMW-GS和LMW-GS會通過二硫鍵結(jié)合形成谷蛋白聚合體。新型HMW-GS促進(jìn)了CS-1Mg籽粒發(fā)育過程中UPP的積累速率，CS只在籽粒發(fā)育的開始和接近成熟期快速的積累UPP，而CS-1Mg在籽粒的發(fā)育的全過程中幾乎一直保持著一個高于CS的積累速率，呈現(xiàn)出一種穩(wěn)步上升的趨勢。在面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)與微觀結(jié)構(gòu)上，新型HMW-GS使得一部分由于蛋白聚合作用形成的β折疊轉(zhuǎn)化為親水的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出更好的二級結(jié)構(gòu)組成，加強(qiáng)了面團(tuán)的與水的結(jié)合能力，使得CS-1Mg面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更緊密，從而提高了面筋強(qiáng)度。

總的來說，新型HMW-GS使得CS-1Mg表現(xiàn)出了更好的蛋白質(zhì)組分，進(jìn)一步影響了其二級結(jié)構(gòu)與微觀結(jié)構(gòu)，在宏觀上表現(xiàn)出流變學(xué)特性的提高以及具有更好的加工品質(zhì)。

在小麥近緣屬種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多優(yōu)秀的抗病、抗蟲基因和異源貯藏蛋白基因，且普通小麥具有龐大且復(fù)雜的基因組，具備接受與融合外源染色體片段的能力，通過染色體工程轉(zhuǎn)移一條或者多條染色體至小麥中，將近緣屬中的優(yōu)質(zhì)基因?qū)氲叫←溨锌蓜?chuàng)制出小麥異附加系，對擴(kuò)大小麥育種的種質(zhì)資源有重大意義。由此已選育出優(yōu)異的小麥品種(小偃系列、陜麥系列)。本試驗(yàn)所使用的小麥-卵穗山羊草1Mg異附加系克服了卵穗山羊草加工特性差的缺點(diǎn)，能夠直接作為試驗(yàn)材料對其籽粒貯藏蛋白與面粉和面團(tuán)品質(zhì)進(jìn)行一系列研究。本研究中未對CS-1Mg的農(nóng)藝性狀、抗逆性、環(huán)境適應(yīng)性等進(jìn)行測定和評價(jià)，無法像Du等[29]篩選出的GN05異附加系一樣作為一個潛在的優(yōu)質(zhì)品種直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。但CS-1Ug中卵穗山羊草1Mg染色體上的異源貯藏蛋白基因能正常表達(dá)，所攜帶的新型HMW-GS能夠顯著的提高面團(tuán)的強(qiáng)度，改善面團(tuán)品質(zhì)，可以作為中間材料和定向提供優(yōu)質(zhì)貯藏蛋白基因源，用于選育優(yōu)良加工品質(zhì)的小麥品種。