欒海業(yè)，徐 肖，陶 紅，臧 慧，張英虎，喬海龍，楊紅燕，陳 健，陳 和，沈會(huì)權(quán)

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224002)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上四大禾谷類作物之一，具有生育期短、抗病和耐逆(耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠)等特點(diǎn)，對(duì)氣候環(huán)境適應(yīng)性較廣泛；大麥主要用途有飼料、麥芽啤酒、食糧及工業(yè)原料等，并且是青藏高海拔地區(qū)最主要的糧食作物。大麥?zhǔn)嵌扼w自花授粉作物，染色體數(shù)為2n=2x=14，基因組大小為5.1 Gb，目前大麥基因組圖譜已公布，2012年，多國(guó)科學(xué)家利用Illumina和Roche 454測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建了4.98 Gb的大麥基因組物理圖譜，并揭示了3.2×104個(gè)基因的排列順序和結(jié)構(gòu)[1]；2017年，國(guó)際大麥測(cè)序聯(lián)盟綜合運(yùn)用染色體構(gòu)象作圖等多種最先進(jìn)的測(cè)序和組裝技術(shù)，組裝出了迄今最完整的大麥基因組物理圖譜，并提供了3.9×104個(gè)基因的高可信度信息[2]。大麥具有遺傳背景簡(jiǎn)單，遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)容易的特點(diǎn)，是麥類作物功能基因組研究的重要模式植物。

突變體庫(kù)的創(chuàng)建是植物功能基因組學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，目前在擬南芥[3]、水稻[4]等模式作物上均已構(gòu)建了飽和的突變體庫(kù)，并利用突變體材料，克隆了大量的功能基因[5-6]。突變體庫(kù)的構(gòu)建還可以創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，豐富品種的遺傳多樣性，為新品種選育提供基礎(chǔ)材料。甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)化學(xué)誘變技術(shù)是構(gòu)建植物突變體庫(kù)的重要方法之一，具有誘變效率高，染色體畸變率較低，且多為點(diǎn)突變等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用于各種作物突變體庫(kù)的構(gòu)建[7]。孫玉龍等[8]通過(guò)EMS對(duì)高產(chǎn)、抗白粉小麥?zhǔn)⑥r(nóng)1號(hào)進(jìn)行誘變，獲得174個(gè)突變穗系，在M3代中得到18個(gè)穩(wěn)定遺傳的株系，其中4個(gè)株系小穗性狀優(yōu)于盛農(nóng)1號(hào)；張 彬等[9]通過(guò)對(duì)糜子進(jìn)行EMS處理，構(gòu)建了變異類型豐富的糜子突變體庫(kù)，篩選到104個(gè)形態(tài)性狀變異株系；霍朋杰[10]利用EMS對(duì)裸燕麥進(jìn)行誘變處理，獲得了表型變異豐富的EMS誘變系，2 000個(gè)M2株系中，鑒定到196份表型突變材料，變異率為9.8%。不同作物突變體的獲得為作物功能基因的克隆及驗(yàn)證提供了豐富的基礎(chǔ)材料。

目前國(guó)內(nèi)外已構(gòu)建了多個(gè)大麥EMS突變體庫(kù)并利用突變體開展了相關(guān)研究，如Caldwell等[11]對(duì)二棱大麥品種Optic構(gòu)建了2個(gè)EMS誘變突變體庫(kù)，獲得了大約20 000個(gè)M2株系，并對(duì)其中的9 216個(gè)株系進(jìn)行了定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(targeting induced local lesions in genomes,TILLING)分析；齊新麗等[12]對(duì)美國(guó)大麥品種Tamalpais進(jìn)行EMS誘變處理，構(gòu)建了表型變異豐富的突變體庫(kù)，并利用TILLING技術(shù)成功獲得了大麥茉莉酸受體基因(COI1)的突變體；呂瑞華等[13]利用EMS誘變技術(shù)，構(gòu)建了大麥品種西引2號(hào)的TILLING篩選群體，并利用該群體對(duì)大麥抗病基因(EDR1)的突變體進(jìn)行了檢測(cè)。與擬南芥、水稻和小麥相比，大麥突變庫(kù)的構(gòu)建還遠(yuǎn)沒有達(dá)到飽和狀態(tài)，尤其是我國(guó)構(gòu)建的大麥突變體庫(kù)還較少，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)大麥功能基因組學(xué)的發(fā)展；要獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要的功能基因，首先應(yīng)以當(dāng)?shù)赝茝V品種為材料自主構(gòu)建大麥突變體庫(kù)。本研究旨在利用抗黃花葉病的優(yōu)質(zhì)啤酒大麥品種蘇啤6號(hào)構(gòu)建大麥突變體庫(kù)，為大麥功能基因組學(xué)研究和遺傳育種提供新突變體材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大麥品種蘇啤6號(hào)由江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所利用浙皮1號(hào)為母本，用該所選育的單二大麥品種為父本，進(jìn)行人工雜交組配，后經(jīng)連續(xù)多年系譜選育而成。該品種為弱春性中熟二棱皮大麥，幼苗半直立，分蘗力中等偏上，株型較緊湊，耐肥抗倒性好，大穗大粒，后期熟相好，麥芽品質(zhì)好，高抗大麥黃花葉病，目前是江蘇及周邊地區(qū)主栽大麥品種。

1.2 研究方法

1.2.1 EMS 誘變

選取籽粒均勻、飽滿的蘇啤6號(hào)種子6 000粒，用濃度為0.5%的EMS溶液浸泡，并在室溫條件下于振蕩器上350 r·min-1振蕩10 h，種子用流水沖洗3 h后，自然晾干。

1.2.2 誘變種子的種植及性狀調(diào)查

2015年11月將誘變種子播種于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗(yàn)場(chǎng)，2016年6月收獲大約2 400個(gè)M1代單株。2016年11月每個(gè)單株種子種植1行，行長(zhǎng)1.5 m，行距25 cm，株距 5 cm，并設(shè)野生型蘇啤6號(hào)為對(duì)照，對(duì)M2代株系表型進(jìn)行全生育期調(diào)查記載，主要記錄幼苗生長(zhǎng)習(xí)性、葉形、葉色、分蘗力、株高、抽穗期、抗病性、棱型和穗型等性狀，篩選形態(tài)明顯變異的突變株行(以下稱其為株系)。2017年11月將篩選出的變異材料繼續(xù)播種于試驗(yàn)田中，鑒定其表型變異的穩(wěn)定性。

1.2.3 M2代表型突變頻率的計(jì)算

M2代突變頻率=M2代突變株系/M2代總株系×100%

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)用0.5%的EMS誘變處理大麥種子，萌發(fā)后的大麥幼苗生長(zhǎng)明顯受到影響，出苗比對(duì)照約遲5 d左右，并有黃化及白化苗現(xiàn)象，M1代單株成活率大約為40%。2 400個(gè)M1突變單株自交獲得M2代，在正常播種條件下，對(duì)M2代株系的主要農(nóng)藝性狀及生物學(xué)性狀進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，經(jīng)EMS誘變后，蘇啤6號(hào)產(chǎn)生了豐富的表型變異，在所調(diào)查的幼苗生長(zhǎng)習(xí)性、葉形、葉色、分蘗數(shù)、株高、抽穗期、棱型和穗型等性狀中均發(fā)現(xiàn)了突變單株或株系(表1)。M2代共發(fā)現(xiàn)突變株系152個(gè)，突變頻率為6.33%。

2.1 幼苗習(xí)性突變

野生型蘇啤6號(hào)幼苗為半直立型，在調(diào)查的2 400個(gè)M2株系中，共發(fā)現(xiàn)36個(gè)株系的幼苗習(xí)性發(fā)生了5種類型(匍匐、白化、黃化、叢生、彎曲)的突變，總的突變頻率為1.43%(表1)。其中，幼苗匍匐型突變株系有3個(gè)，突變頻率為0.13%(圖1A)；幼苗發(fā)生白化死亡的株系有10個(gè)，突變頻率為0.42%；幼苗整個(gè)植株或整個(gè)生育期發(fā)生黃化的突變株系有15個(gè)，突變頻率為0.63%，該性狀在M3代可以穩(wěn)定遺傳(圖1B)；幼苗叢生型突變株系有6個(gè)，突變頻率為 0.25%(圖1C)；幼苗彎曲型突變株系有2個(gè)，突變頻率為0.08%(圖1D)。

A：幼苗匍匐；B：黃化苗；C：幼苗叢生；D：幼苗彎曲；E：野生型。

表1 EMS誘變M2代各種突變表型的突變頻率

2.2 葉片突變

在2 400個(gè)M2代株系中，共發(fā)現(xiàn)34個(gè)株系的葉片發(fā)生了葉片黃條、白條、紅綠葉、白葉耳、葉病斑、旗葉卷曲、無(wú)旗葉、寬窄葉以及無(wú)葉耳10種類型的變異，總的突變頻率約為1.42%(表1)。葉黃條突變發(fā)生在分蘗期，部分葉片的邊緣黃化，葉綠素含量明顯減少，拔節(jié)期后，黃化葉片逐漸轉(zhuǎn)為綠色，可以正常進(jìn)行光合作用、抽穗和結(jié)實(shí)(圖2A)。葉白條突變出現(xiàn)在幼苗期，返青拔節(jié)后部分植株死亡，部分可以逐漸恢復(fù)(圖2B)。2個(gè)突變株系為紅綠葉突變，葉片同時(shí)具有綠色、白色和紅色，該性狀不能穩(wěn)定遺傳到M3代(圖2C)。白葉耳突變除葉耳顏色為明顯的白色外，其他性狀與野生型沒有明顯差別(圖2D)，M3驗(yàn)證該表型能夠穩(wěn)定遺傳，M2群體中葉耳顏色正常植株與白葉耳植株的比例為3∶1。葉病斑突變有兩種類型，一種是全生育期葉片有褐色的類病斑(圖2E)，另一種為全生育期所有綠葉都有白色病斑(圖2F)，這些突變體均不會(huì)導(dǎo)致葉片及植株的死亡，都可以正常抽穗、結(jié)實(shí)，M3代驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該突變表型均可以穩(wěn)定遺傳，后代無(wú)分離現(xiàn)象。旗葉卷曲突變表現(xiàn)為部分旗葉明顯變小卷曲(圖2G)，不利于光合作用的進(jìn)行。無(wú)旗葉突變表現(xiàn)為植株部分分蘗的旗葉缺失(圖2H)，但能夠正常抽穗、結(jié)實(shí)，該性狀并不能穩(wěn)定遺傳。寬窄葉突變表現(xiàn)為葉片變寬或變窄：蘇啤6號(hào)野生型植株的旗葉平均葉寬為1.37 cm，寬葉突變體旗葉平均葉寬為2.75 cm(圖2I)；細(xì)葉突變體旗葉平均葉寬僅為0.72 cm(圖2J)，M3代驗(yàn)證寬窄葉突變表型均可以穩(wěn)定遺傳，后代無(wú)分離。無(wú)葉耳突變材料無(wú)葉耳和葉鞘，葉片豎直向上生長(zhǎng)，株型緊湊，是改良大麥株型的理想材料，通過(guò)對(duì)后代遺傳分析表明，該性狀能穩(wěn)定遺傳，為單基因隱性突變(圖2K)。

A：葉黃條；B：葉白條；C：紅綠葉；D：白葉耳；E和F：葉病斑；G：旗葉卷曲；H：無(wú)旗葉；I：寬葉；J：細(xì)葉；K：無(wú)葉耳；L：野生型。

2.3 莖稈突變

M2代株系中，有33個(gè)突變性狀與莖稈相關(guān)，突變頻率為1.38%。莖稈相關(guān)突變主要包括無(wú)蠟質(zhì)、多節(jié)多葉、株高異常、分蘗異常、莖稈異常及莖稈彎曲6種變異類型。野生型整個(gè)植株均覆蓋有白色的蠟質(zhì)，無(wú)蠟質(zhì)突變單株表現(xiàn)為葉片、莖稈或穗部蠟質(zhì)缺失(圖3A，B)。多節(jié)多葉突變體從拔節(jié)期至抽穗期，節(jié)間和葉片數(shù)目明顯多于野生型，蘇啤6號(hào)野生型主莖葉片的數(shù)目大約為10個(gè)，而該突變體的主莖葉數(shù)目可以達(dá)到15個(gè)，并且每個(gè)節(jié)間明顯變短，穗子變小，該性狀可以穩(wěn)定遺傳(圖3C)。株高突變表現(xiàn)為植株變高和植株矮化，蘇啤6號(hào)植株的高度為76 cm，高稈突變單株有85 cm左右，矮化突變單株大約有20 cm(圖3D)。分蘗突變表現(xiàn)為分蘗數(shù)減少或增加，部分單株僅有一個(gè)分蘗，部分單株有多個(gè)分蘗，分蘗數(shù)平均達(dá)到15個(gè)以上(圖3E)，并且該性狀可以穩(wěn)定遺傳。莖稈異常表現(xiàn)為一個(gè)分蘗有多個(gè)莖稈，穗子不能正常抽出，該性狀不能穩(wěn)定遺傳(圖3F)。莖稈彎曲突變主要表現(xiàn)為抽穗后穗子莖部扭曲(圖3G)，其他性狀與野生型沒有明顯差異。

A和B：無(wú)蠟質(zhì)；C：多節(jié)多葉；D：矮化；E：多分蘗；F：莖稈異常；G：莖稈彎曲；H：野生型。

2.4 穗部突變

M2代株系中發(fā)現(xiàn)了22個(gè)與穗子相關(guān)的突變體，突變頻率為0.92%(表1)，主要包括棱型、異常穗、球穗、淺黃穗、白穎殼、雙穗和穗長(zhǎng)變異7種類型。野生型蘇啤6號(hào)為二棱皮大麥品種，突變材料中發(fā)現(xiàn)了六棱的突變株，并且能夠穩(wěn)定遺傳(圖4A)。異常穗突變棱型介于二棱與六棱之間，一個(gè)穗子中間部位有多排雜亂無(wú)章的籽粒，成熟后，還有部分籽粒無(wú)皮，為裸大麥(圖4B，C)。球穗突變表現(xiàn)為穗子變短、變圓，類似于球型，結(jié)實(shí)率降低(圖4D)。淺黃穗突變表現(xiàn)為灌漿期穗子的顏色為淺黃色，其他性狀與野生型相比，沒有明顯差異(圖4E)。白穎殼突變出現(xiàn)在抽穗至灌漿期，突變株穎殼的顏色為白色，穗子缺失葉綠體，后代驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該性狀可以穩(wěn)定遺傳，為單基因隱性突變(圖4F)。雙穗突變表現(xiàn)為莖稈上面有兩個(gè)穗子，M3代驗(yàn)證表明該性狀不能穩(wěn)定遺傳(圖4G)。穗子長(zhǎng)度突變表現(xiàn)為穗子變長(zhǎng)或變短：野生型穗子長(zhǎng)度為7.2 cm，長(zhǎng)穗突變體平均長(zhǎng)度為9.9 cm，穗粒數(shù)也明顯增多(圖4H)；短穗突變體籽粒變小，排列緊密，平均長(zhǎng)度僅為4.35 cm(圖4I)。

2.5 生育期突變

經(jīng)EMS誘變后，部分大麥的抽穗期與成熟期均發(fā)生了較大的變化。M2代中有6個(gè)早抽穗株系，4個(gè)晚抽穗株系，突變頻率分別為0.25%和0.17%。M2代中有5個(gè)早熟株系，成熟期平均提前了5～10 d；有6個(gè)晚熟株系，成熟期平均推遲了4～7 d。

2.6 育性突變

M2代中共有6個(gè)株系的育性降低，其中有2個(gè)為完全不育，另外4個(gè)育性為10%～40%；開花期不育材料的穎殼膨大、張開，部分接受外部花粉，可以結(jié)實(shí)。有1個(gè)不育材料穎殼中的三枚雄蕊全部突變成了雌蕊(圖4J)。

A：異常棱型；B和C：異常穗；D：球穗；E：淺黃穗；F：白穎殼；G：雙穗；H：長(zhǎng)穗；I：短穗；J：雄性不育；K：野生型。

2.7 純合突變體的農(nóng)藝性狀分析

對(duì)M3代穩(wěn)定的突變體株系進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果表明(表2)，突變?nèi)后w中，在抽穗期、株高、穗長(zhǎng)、單穗穗粒數(shù)、總蛋白含量和總淀粉含量方面均產(chǎn)生了豐富的變異，抽穗期為208～ 227 d，株高為21.67～85.54 cm，穗長(zhǎng)為4.53～10.9 cm，單穗穗粒數(shù)為14.25～72.52，總蛋白含量為12.42%～16.78%，總淀粉含量為 39.46%～ 53.42%；其中單穗穗粒數(shù)與穗長(zhǎng)的變異系數(shù)較大，分別為31.02和13.81。通過(guò)EMS誘變處理，在主要農(nóng)藝性狀方面均產(chǎn)生了不同于野生型的突變體，為以后基礎(chǔ)理論研究及育種工作提供了基礎(chǔ)材料。

表2 M3代純合突變體株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

3 討 論

EMS誘變可以引起表型變異，目前，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于擬南芥、水稻、小麥、糜子、燕麥和大豆等植物中，創(chuàng)制出了許多有價(jià)值的種質(zhì)資源，為作物重要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)特性等相關(guān)基因的克隆提供了材料基礎(chǔ)[3-4,8-10]。然而目前關(guān)于大麥功能基因組學(xué)的研究還處于起步階段，如Qin等[14]通過(guò)圖位克隆的方法，成功克隆了大麥品種鄂大麥6號(hào)階段性白化基因whs18。張曉勤等[15]對(duì)大麥浙農(nóng)大3號(hào)進(jìn)行EMS誘變，得到1 300個(gè)M2株系，篩選出各種形態(tài)突變株系97個(gè)，突變率為 7.46%。本研究以優(yōu)質(zhì)的啤酒大麥品種蘇啤6號(hào)為材料，利用EMS誘變的方法構(gòu)建了大麥突變體庫(kù)，獲得2 400個(gè)M2代材料。對(duì)M2株系進(jìn)行全生育期考察，篩選到152個(gè)突變株系，并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)未見報(bào)道的突變類型，如大麥多葉、三枚雄蕊雌化等。該突變體庫(kù)的創(chuàng)建豐富了大麥突變體庫(kù)，為我國(guó)大麥功能基因組學(xué)研究和新品種選育提供了新的實(shí)驗(yàn)材料。

葉色突變體是研究植物光合作用及光形態(tài)建成等代謝途徑的重要材料，在雜交育種中還可以作為重要的形態(tài)標(biāo)記。水稻上已報(bào)道了190份葉色突變體，并克隆到了30個(gè)相關(guān)調(diào)控基因[16]。大麥上也有相關(guān)葉色突變體的報(bào)道，但克隆的相關(guān)調(diào)控基因還較少。秦丹丹等[17]通過(guò)EMS誘導(dǎo)鄂大麥934，篩選到一個(gè)整個(gè)生育期葉色都為淺黃色的突變體，并將葉色突變基因初步定位到3H的12.7 cM區(qū)間內(nèi)；Wang等[18]將受高溫誘導(dǎo)的大麥黃化基因vvy初步定位到4H的長(zhǎng)臂上；本課題組前期發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大麥白色穎殼突變體，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析初步了解了其形成的分子機(jī)理[19]。本研究所構(gòu)建的蘇啤6號(hào)突變體庫(kù)中也發(fā)現(xiàn)多個(gè)葉色突變體，包括葉片黃化、白化、白條紋、黃條紋、紅色條紋、白葉耳和白穎殼等，今后將通過(guò)構(gòu)建遺傳群體，進(jìn)一步研究這些突變的形成機(jī)理。

表皮蠟質(zhì)是覆蓋于陸生植物外部的一層有機(jī)化合物，對(duì)于植物適應(yīng)各種逆境環(huán)境(干旱、病蟲害等)具有重要作用。在擬南芥、水稻和玉米等植物中已篩選到大量蠟質(zhì)缺失突變體，目前在擬南芥中已克隆出幾十個(gè)與蠟質(zhì)合成和調(diào)控相關(guān)的基因，為表皮蠟質(zhì)合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析奠定了基礎(chǔ)[20]。在麥類作物中，通過(guò)圖位克隆得到的蠟質(zhì)相關(guān)基因還較少，Li等[21]通過(guò)誘變得到了大麥葉片蠟質(zhì)缺失突變體cer-ym，表現(xiàn)出對(duì)干旱敏感，并利用F2群體將該基因初步定位到4H染色體上；Zhou等[22]將大麥葉片和穗部蠟質(zhì)缺失基因cer-b2定位到3H染色體1.3 cM區(qū)間內(nèi)。本研究共鑒定出各種蠟質(zhì)缺失突變體15份，并對(duì)穗部蠟質(zhì)缺失突變體和野生型進(jìn)行了形態(tài)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，從細(xì)胞和分子水平上初步解釋了穗部蠟質(zhì)缺失性狀形成的機(jī)理[23]。

葉夾角是決定作物理想株型的重要因素之一，葉夾角大小與葉耳的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了2個(gè)無(wú)葉耳突變系，葉片與主莖間夾角明顯減小，葉片呈直立向上的形態(tài)，個(gè)體間對(duì)光能吸收的競(jìng)爭(zhēng)減少，適合密植，有增產(chǎn)的潛力。在水稻和玉米上已有無(wú)葉耳突變體的相關(guān)報(bào)道[24-25]，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了精細(xì)定位，可能與SBP轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，大麥上還未見相關(guān)基因被克隆報(bào)道。本研究還發(fā)現(xiàn)了1個(gè)雄蕊雌化突變系，穎殼內(nèi)的三枚雄蕊全部突變成了雌蕊，該突變體的發(fā)現(xiàn)對(duì)研究麥類作物花器官發(fā)育的分子機(jī)理以及不育系雜交育種研究都具有重要意義。

本研究對(duì)EMS誘變產(chǎn)生的突變株系的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)了一批穩(wěn)定的優(yōu)良株系，比如矮稈、多葉(用于大麥青貯)、早熟和低蛋白等性狀優(yōu)良的突變株，這些優(yōu)異種質(zhì)資源可以直接應(yīng)用到大麥育種中。