陳小麗 李紅霞 楊 磊 徐 立

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○六醫(yī)院，浙江 寧波 315040）

線(xiàn)粒體是細(xì)胞能量合成中心，是缺血性損害最主要的亞細(xì)胞靶區(qū)之一，其功能障礙所致能量耗竭而引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死是缺血性腦損傷直接和間接原因［1-2］。白芍總苷為毛茛科白芍屬植物白芍的活性成分，既往張玥［3］、史晴晴［4］等研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠通過(guò)改善血液流變學(xué)指標(biāo)、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而對(duì)缺血性腦損傷起到一定的保護(hù)作用，此外史晴晴等［5］還發(fā)現(xiàn)白芍總苷通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)腦缺血中樞海馬組織具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)將探討白芍總苷預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬線(xiàn)粒體功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（浙）2014-0005］，動(dòng)物批次號(hào)：20181009013。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，光照/黑暗周期1∶1，恒室溫（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%；術(shù)前24 h禁食，飲水不限。

1.2 試藥與儀器

1）藥物：白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司，批號(hào)：201804005），尼莫地平片（上海信誼天平藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)18062405）。2）試劑：ATP測(cè)定試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；MPTP開(kāi)放度、△ψm檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。3）儀器：UV759型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；Chlorolab-2型氧電極（英國(guó)Hansatech公司）；UV759型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；H-7650型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；RM2125型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；MTP-601F型熒光酶標(biāo)儀［天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司］。

1.3 分組與造模

取120只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，白芍總苷低、中、高劑量組和尼莫地平組，各20只。參照裴科陽(yáng)等［6］報(bào)道，采用線(xiàn)栓法制備缺血性腦損傷大鼠模型：實(shí)施麻醉后沿頸部正中切口，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈（充分暴露三者分叉處），結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于分叉處近心端頸總動(dòng)脈切口、插入線(xiàn)栓進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，遇阻力止，深度距分叉處約18 mm，固定線(xiàn)栓后逐層縫合，消毒；假手術(shù)組除不插入線(xiàn)栓外，其余同模型組。

1.4 干預(yù)方法

白芍總苷低、中、高劑量組按50、100、200 mg/（kg·d）給藥，尼莫地平組按1 mg/（kg·d）給藥。藥液配制：1）精確稱(chēng)取白芍總苷膠囊內(nèi)充藥物400 mg，加入0.9%氯化鈉溶液10 mL制備白芍總苷溶液，質(zhì)量濃度為40 mg/mL，并依次稀釋制備20 mg/mL、10 mg/mL質(zhì)量濃度的白芍總苷溶液。2）尼莫地平片研碎后，精確稱(chēng)取1 mg尼莫地平粉末并加入0.9%氯化鈉溶液5 mL制備0.2 mg/mL的尼莫地平溶液。假手術(shù)組和模型組同步給予等體積（5 mL/kg）的0.9%氯化鈉溶液。各組均于造模術(shù)前7 d開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，共28 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 線(xiàn)粒體呼吸功能測(cè)定 1）線(xiàn)粒體提取：各組分別隨機(jī)取10只大鼠，深度麻醉后斷頭取腦，迅速剝?nèi)∪毖獋?cè)海馬組織，參照李富強(qiáng)等［2］報(bào)道的方法制備海馬區(qū)線(xiàn)粒體，Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。2）改良Clark氧電極法［7］測(cè)定線(xiàn)粒體呼吸功能：連續(xù)描記Ⅲ態(tài)（R3）快速耗氧及腺苷二磷酸完全磷酸化后的Ⅳ態(tài)（R4）耗氧曲線(xiàn)，R3、R4耗氧速率比值為呼吸控制率（RCR），根據(jù)耗氧曲線(xiàn)計(jì)算磷氧比（P/O）和氧化磷酸化效率（OPR）。

1.5.2 線(xiàn)粒體ATP含量及游離Ca2+濃度測(cè)定 取制備的線(xiàn)粒體，通過(guò)超聲波破碎后，采用比色法測(cè)定ATP含量。采用原子化學(xué)發(fā)光法，以CaCO3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定游離Ca2+濃度。

1.5.3 TEM觀(guān)察超微結(jié)構(gòu) 各組取剩余10只大鼠，麻醉后取大腦并進(jìn)行4%多聚甲醛溶液組織固定，剝離海馬，切割成約1 mm3小塊后置4℃預(yù)冷的3%戊二醛溶液中固定2 h，PBS溶液浸洗30 min，置于1%四氧化鋨溶液于4℃下再固定2 h，然后依次經(jīng)梯度酒精脫水、還氧丙烷置換和環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透、包埋、聚合、光學(xué)顯微鏡下定位后，60 nm厚度超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，由10 000倍TEM觀(guān)察海馬線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.5.4 線(xiàn)粒體腫脹程度、膜流動(dòng)性和膜總磷脂含量測(cè)定 1）線(xiàn)粒體腫脹程度［8］：取制備的線(xiàn)粒體懸液并加入適量蔗糖溶液，4℃低溫離心（離心力7 000g，10 min）后去上清，重復(fù)1次。依次加入1 mL蔗糖溶液、1 μL CaCl2溶液（濃度200 mmol/L），通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，A520越小，腫脹程度越高。2）線(xiàn)粒體膜流動(dòng)性：參照孟偉峰等［9］報(bào)道，采用熒光偏振度法測(cè)定線(xiàn)粒體膜流動(dòng)性，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光偏振度P（激發(fā)波長(zhǎng)362 nm，發(fā)射波長(zhǎng)432 nm），微黏度（η）=2P（0.46-P），η越小，膜流動(dòng)性越大。3）膜總磷脂含量：采用Trinder酶試劑盒測(cè)定線(xiàn)粒體膜總磷脂含量。

1.5.5 MPTP開(kāi)放度、△ψm水平測(cè)定 1）MPTP開(kāi)放度測(cè)定：遵照試劑盒說(shuō)明，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)540 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm），熒光強(qiáng)度越高表示MPTP開(kāi)放度越高。2）膜電位測(cè)定：遵照試劑盒說(shuō)明，采用JC-1法、通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)△ψm（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行最小顯著差異LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬線(xiàn)粒體呼吸功能指標(biāo)比較

見(jiàn)表1。較假手術(shù)組，模型組呼吸功能指標(biāo)R3、RCR、P/O、OPR降低且R4顯著升高（P<0.01）。經(jīng)白芍總苷中、高劑量預(yù)處理或尼莫地平預(yù)處理能夠顯著抑制R3、RCR、P/O、OPR值降低和R4值升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。較尼莫地平組，白芍總苷高劑量預(yù)處理組R3值顯著降低（P<0.05），其他指標(biāo)值兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)線(xiàn)粒體呼吸功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)線(xiàn)粒體呼吸功能指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，??P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與尼莫地平組比較，#P<0.05。下同

P/O組 別n OPR（nmol/min）161.08±22.53 64.35±10.07**71.46±11.32 98.43±13.15△136.70±23.81△△131.58±25.34△△假手術(shù)組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組尼莫地平組10 10 10 10 10 10 R3［nmol/（min·mg）］70.41±6.57 42.05±4.99**45.73±5.68 53.51±5.37△△64.15±5.60△△#56.28±5.36△△R4［nmol/（min·mg）］24.20±3.68 31.37±4.54**29.61±4.43 26.37±3.49△△24.28±3.45△△25.11±3.42△△RCR（%）2.79±0.35 1.35±0.23**1.58±0.29 2.10±0.40△△2.57±0.42△△2.49±0.38△△2.51±0.30 1.36±0.22**1.53±0.25 1.88±0.24△△2.34±0.31△△2.28±0.29△△

2.2 各組大鼠海馬線(xiàn)粒體ATP含量及游離Ca2+濃度指標(biāo)比較

見(jiàn)表2。較假手術(shù)組，模型組大鼠ATP含量顯著降低且游離Ca2+濃度顯著升高（P<0.01）；經(jīng)白芍總苷中、高劑量預(yù)處理或尼莫地平預(yù)處理能夠明顯抑制ATP含量的降低和游離Ca2+濃度的升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；較尼莫地平組，白芍總苷高劑量組ATP含量顯著升高且游離Ca2+濃度顯著降低（P<0.05）。

表2 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)線(xiàn)粒體ATP含量及游離Ca2+濃度（±s）

表2 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)線(xiàn)粒體ATP含量及游離Ca2+濃度（±s）

組別假手術(shù)組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組尼莫地平組n 10 10 10 10 10 10 ATP（μmol/g）0.99±0.14 0.40±0.07**0.45±0.07 0.67±0.12△△0.84±0.15△△#0.69±0.13△△游離Ca2+（nmol/g）13.01±1.79 29.75±4.57**28.41±4.62 25.58±4.43△20.09±3.30△△#23.94±3.81△△

2.3 各組大鼠缺血側(cè)海馬線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)改變

見(jiàn)圖1。通過(guò)TEM觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯異常，模型組呈現(xiàn)線(xiàn)粒體數(shù)量減少，基質(zhì)透明化，膜磷脂層破壞，水腫、崩解，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；經(jīng)白芍總苷和尼莫地平預(yù)處理能夠不同程度地抑制缺血性腦損傷大鼠海馬線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)病變，以白芍總苷高劑量組最為顯著。

圖1 各組大鼠海馬線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)檢查結(jié)果（10 000倍）

2.4 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)線(xiàn)粒體膜腫脹程度、膜流動(dòng)性、膜總磷脂含量比較

見(jiàn)表3。較假手術(shù)組，模型組線(xiàn)粒體膜磷脂層被破壞，A520降低，表現(xiàn)為線(xiàn)粒體膜腫脹，η升高，表現(xiàn)為線(xiàn)粒體膜流動(dòng)性降低，線(xiàn)粒體膜總磷脂含量降低（P<0.05或P<0.01）。白芍總苷中、高劑量組和尼莫地平組能夠明顯抑制A520值降低，并抑制η值升高，提示白芍總苷和尼莫地平預(yù)處理能夠抑制線(xiàn)粒體腫脹、改善線(xiàn)粒體膜流動(dòng)性，并且白芍總苷中、高劑量預(yù)處理能夠明顯抑制膜總磷脂含量降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。較尼莫地平組，白芍總苷高劑量組抑制線(xiàn)粒體腫脹作用顯著升高（P<0.05），兩組間膜流動(dòng)性和膜總磷脂含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)線(xiàn)粒體MPTP開(kāi)放度、△ψm比較

見(jiàn)表3。較假手術(shù)組，模型組MPTP開(kāi)放度顯著升高且△ψm顯著降低（P<0.01）。經(jīng)白芍總苷中、高劑量和尼莫地平預(yù)處理能夠顯著抑制MPTP開(kāi)放度升高并抑制△ψm降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與尼莫地平組比較，白芍總苷高劑量組MPTP開(kāi)放度顯著降低、△ψm顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)線(xiàn)粒體腫脹程度、膜流動(dòng)性、膜總磷脂含量比較（±s）

表3 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)線(xiàn)粒體腫脹程度、膜流動(dòng)性、膜總磷脂含量比較（±s）

組別n假手術(shù)組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組尼莫地平組10 10 10 10 10 10腫脹程度（100×A520值）92.75±9.81 43.48±8.12**膜流動(dòng)性［η值（Pa/s）］2.81±0.67 4.90±0.54**膜總磷脂含量（mol/mg）453.17±50.86 345.14±46.73**MPTP開(kāi)放度［熒光強(qiáng)度（RFU）］23584.31±2491.28 40200.52±3517.35**△ψm［熒光強(qiáng)度（RFU）］40597.64±3651.32 25203.38±2758.40**50.25±9.68 68.31±9.76△△82.59±10.28△△#71.64±9.31△△4.48±0.59 4.06±0.63△3.38±0.50△△3.62±0.49△△367.58±44.39 395.70±46.25△416.49±51.37△393.16±41.82△37187.29±3538.60 33467.59±3407.52△△28761.42±3102.76△△##33991.38±3489.72△27425.13±2910.57 29011.47±2949.80△32384.63±3080.25△△#28588.59±2749.32△

3 討 論

線(xiàn)粒體最重要的生理功能之一是通過(guò)呼吸鏈反應(yīng)產(chǎn)生ATP而供給能量，線(xiàn)粒體受損所致能量代謝障礙是缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良Clark氧電極法檢測(cè)線(xiàn)粒體呼吸功能，顯示缺血性腦損傷大鼠海馬區(qū)線(xiàn)粒體呼吸功能降低，與李富強(qiáng)等［10］研究結(jié)論一致。線(xiàn)粒體呼吸功能降低將直接導(dǎo)致ATP合成受阻并間接影響能量依賴(lài)性的ATP酶活性，其中Na+-K+-ATP酶活性降低將導(dǎo)致Na+內(nèi)流而引發(fā)Na+/Ca2+交換，使Ca2+進(jìn)入線(xiàn)粒體，正常情況下Ca2+泵能夠在Ca2+-ATP酶作用下被泵出而維持線(xiàn)粒體Ca2+平衡，但ATP合成受阻所致Ca2+-ATP酶活性降低而使線(xiàn)粒體Ca2+泵出受限而引發(fā)鈣超載［11］，并且鈣超載將抑制線(xiàn)粒體氧化磷酸化功能而抑制ATP合成，從而形成“ATP合成障礙-鈣超載-ATP合成障礙”的惡性循環(huán)，最終加重缺血性腦損傷。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與模型組、陽(yáng)性藥物（尼莫地平）預(yù)處理組比較，白芍總苷預(yù)處理能夠顯著抑制缺血性腦損傷大鼠海馬線(xiàn)粒體呼吸功能、ATP含量降低，抑制游離Ca2+濃度升高，提示白芍總苷預(yù)處理具有保護(hù)缺血性腦損傷大鼠海馬線(xiàn)粒體功能的作用。

線(xiàn)粒體是易受缺血性腦損傷累及的細(xì)胞器之一，而線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整是維持其功能的基礎(chǔ)。為進(jìn)一步探討白芍總苷上述作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)線(xiàn)粒體呈現(xiàn)數(shù)量減少，基質(zhì)透明化，膜磷脂層破壞，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大等明顯的超微結(jié)構(gòu)病變，該結(jié)果與 Jankauskas SS［12］、余婷［13］等的研究結(jié)論一致。此外，缺血性腦損傷將導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜腫脹程度升高、膜流動(dòng)性降低、膜磷脂含量降低。線(xiàn)粒體為膜性細(xì)胞器，其生理功能依賴(lài)膜結(jié)構(gòu)的完整性，而上述3項(xiàng)指標(biāo)能夠反映線(xiàn)粒體膜完整性及其功能。本研究結(jié)果顯示，白芍總苷預(yù)處理能夠有效抑制海馬區(qū)線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)病變和膜病變。

△ψm對(duì)維持線(xiàn)粒體功能起著關(guān)鍵作用，其與ATP合成密切相關(guān)。Alizadeh R等［14］研究發(fā)現(xiàn)△ψm降低將直接導(dǎo)致ATP合成減少并影響正常生命活動(dòng)。MPTP是一種非特異性通道，當(dāng)膜完整性遭到破壞時(shí)MPTP開(kāi)放度升高，致使正常生理狀態(tài)下不能通過(guò)的大分子量離子自由通過(guò)，破壞離子平衡，此外李強(qiáng)等［15］研究發(fā)現(xiàn)MPTP開(kāi)放度升高將導(dǎo)致△ψm下降、釋放促凋亡蛋白而觸發(fā)線(xiàn)粒體凋亡通路。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白芍總苷預(yù)處理能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠海馬區(qū)線(xiàn)粒體△ψm的降低和MPTP開(kāi)放度的升高。

綜上所述，白芍總苷預(yù)處理具有保護(hù)缺血性腦損傷大鼠海馬線(xiàn)粒體功能的作用，其機(jī)制可能與抑制線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)病變及保護(hù)線(xiàn)粒體膜完整性有關(guān)。