金 恒 凌家艷△ 徐派的

（1.湖北省武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061）

功能性消化不良（FD）是一種無器質(zhì)性病變的胃腸疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與胃腸運動障礙、腦腸互動異常、腸道菌群失調(diào)、內(nèi)臟敏感性增高、腸道低度炎癥、精神心理因素等密切相關(guān)，其中因生活工作壓力等精神心理因素致病率較高［1-2］。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）可在外周及中樞分泌，是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌肽。研究發(fā)現(xiàn)［3］，有焦慮、抑郁行為的大鼠部分腦區(qū)CRF水平增加，當(dāng)給大鼠注射外源性CRF制劑時會引起焦慮樣行為。因此，CRF及其受體與精神因素相關(guān)。本實驗探究CRF及其受體在FD發(fā)病中的作用，探討FD的發(fā)病機(jī)制，為針刺治療FD提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，購于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。將其飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心SPF動物房。室溫22～25℃，相對濕度50%～70%。在明暗12 h交替光照環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。本實驗所有操作均符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的各項規(guī)定。

1.2 試劑及儀器 1）試劑：CRF、CRF-R1、CRF-R2、β-actin抗體（美國Abcam公司）；磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；水合氯醛（上海國藥集團(tuán)公司）。2）儀器：HAMS-200A穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），針灸針（規(guī)格：直徑0.22 mm，長25 mm，中研太和一次性無菌針灸針），垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠），全自動酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾公司），離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），曠場實驗箱（上海欣欣），自制大鼠鼠衣及懸掛大鼠裝置。

1.3 分組及造模 將36只大鼠隨機(jī)分為正常組12只，造模組24只。采用改良夾尾法+0℃生理鹽水灌胃+不規(guī)則飲食法同時干預(yù)建立FD大鼠模型［4-5］。具體方法如下：用尖端纏繞厚膠布的止血鉗夾住大鼠尾巴末端1/3處，令大鼠尖叫、站立并與同籠大鼠互相廝打。鉗夾大鼠尾部以不破皮為度。若有皮損注意隨時用5%皮膚消毒劑消毒。于每日9∶00及15∶00兩個時間段各夾尾1次，每次持續(xù)30 min。每次夾尾結(jié)束后用0℃ 0.9%氯化鈉注射液灌胃，每只2 mL，每日2次。同時逢單日禁食，雙日給予300 g飼料，自由飲水。以上干預(yù)持續(xù)2周。若大鼠出現(xiàn)毛發(fā)雜亂、發(fā)黃，大便稀溏、惡臭，反應(yīng)遲鈍，喜蜷縮等癥狀后，隨機(jī)選取兩只大鼠解剖發(fā)現(xiàn)無腹部異常、胃腸潰瘍等器質(zhì)性病變，表明造模成功。造模過程中，正常組正常飲食，同造模大鼠一樣實施抓取，不進(jìn)行夾尾及0℃生理鹽水灌胃等操作。造模結(jié)束后，成模大鼠分為模型組11只，電針組11只。

1.4 干預(yù)方法 電針組在造模結(jié)束后第2天開始干預(yù)。將大鼠穿上自制鼠衣固定于鼠架后，參照《實驗針灸學(xué)》［6］“足三里”（即大鼠“后三里”）及“太沖”穴定位。75%酒精棉球消毒后用針灸針直刺2～8 mm，分別將兩側(cè)“足三里”穴及“太沖”穴接HAMS-200 A電針儀，參數(shù)設(shè)置為連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度1 mA，每次干預(yù)30 min，每日1次，連續(xù)干預(yù)14 d。正常組、模型組不予干預(yù)，但是在電針組干預(yù)期間行同樣抓取、穿鼠衣、鼠架懸掛固定。

1.5 曠場實驗 參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行曠場試驗，每只大鼠當(dāng)日測定1次，觀察時間為3 min。保持實驗室安靜、適宜室溫（22～25℃）及適宜光線強(qiáng)度。觀測指標(biāo)：根據(jù)攝像機(jī)記錄的視頻來記錄大鼠水平運動格數(shù)、中央格停留時間及垂直站立的次數(shù)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 采用Western blotting檢測CRF、CRF-R1、CRF-R2的表達(dá)。處死大鼠，將下丘腦組織加入細(xì)胞蛋白裂解液提取蛋白，提取總蛋白之后用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度。配置8%的SDS-PAGE凝膠，加樣后恒壓電泳跑膠，隨后恒流轉(zhuǎn)膜。加入5%的脫脂奶粉封閉過夜，分別加CRF、CRF、CRF-R1、CRFR2抗體后孵育2 h。清洗3次后加二抗，再次孵育2 h，顯色，暗室曝光，用Quantity One軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠水平運動格數(shù)、垂直運動次數(shù)及中央格停留時間均顯著減少（P<0.01）。與模型組相比較，電針組大鼠水平運動格數(shù)、垂直運動次數(shù)及中央格停留時間顯著增加（P<0.01）。提示模型組大鼠焦慮抑郁狀態(tài)嚴(yán)重，經(jīng)電針干預(yù)后大鼠焦慮抑郁情況明顯減輕。

表1 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較（±s）

與正常組比較，?P<0.01；與模型組比較，△P<0.01。下同

組 別n 水平運動（格）垂直運動（次）中央格停留時間（s）正常組模型組電針組12 11 11 104.23±2.19 72.93±5.16*98.34±7.15△10.24±1.34 4.65±2.26*9.09±1.23△7.56±1.67 2.12±1.03*5.87±2.18△

2.2 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的表達(dá)比較 見表2，圖1。與正常組比較，各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1表達(dá)增多，CRF-R2表達(dá)減少。電針干預(yù)后，與模型組比較，CRF、CRF-R1表達(dá)減少，CRF-R2表達(dá)增多。因此電針可下調(diào)下丘腦CRF，CRF-R1的表達(dá)，上調(diào)下丘腦CRF-R2的表達(dá)。

3 討論

隨著生活及工作壓力增加，人們都存在不同程度的情緒障礙，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，增加社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)。已有實驗證明，心理疾病及精神障礙等因素是FD的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制之一［8］。根據(jù)FD的癥狀，中醫(yī)學(xué)將其歸于“胃脘痛”“痞滿”范疇，本病病位在胃，涉及肝脾。多為肝氣郁滯，疏泄失職，橫逆乘脾犯胃，脾胃升降失常，久則肝脾耗傷，脾失健運，運化無力。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛證是FD主要病機(jī)［9］，因此，本研究采用復(fù)合因素干預(yù)造模，對大鼠胃腸形成慢性刺激，耗損脾胃之氣，久之脾胃之氣虛弱。另外夾尾法使大鼠暴怒后，郁怒傷肝，綜合辨證則為肝郁脾虛型FD。根據(jù)大鼠從易怒、反應(yīng)快速至逐漸出現(xiàn)毛色枯黃、大便稀溏、喜蜷臥等癥狀，加之無器質(zhì)性病變作為模型評價標(biāo)準(zhǔn)。

表2 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的相對表達(dá)含量比較（±s）

表2 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的相對表達(dá)含量比較（±s）

組別正常組模型組電針組n 12 11 11 CRF/GAPDH 0.43±0.05 0.91±0.02*0.51±0.05△CRF-R1/GAPDH 0.45±0.04 1.01±0.02*0.63±0.02△CRF-R2/GAPDH 1.11±0.01 0.46±0.35*0.69±0.03△

圖1 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的表達(dá)

現(xiàn)階段，因西藥副作用大、療效不確定、個體差異性大等因素導(dǎo)致FD西藥療法具有較大局限性。而中醫(yī)療法獨具特色，副作用小，因此逐漸被廣大醫(yī)師及患者接受。電針療法屬于中醫(yī)療法。研究表明［10-12］，電針治療FD療效確切。因肝郁脾虛證為FD發(fā)病的主要病機(jī)，因此采用疏肝健脾為基本治則。本研究選取的足陽明胃經(jīng)合穴足三里可健脾益氣，增強(qiáng)脾胃運化，降逆理氣，是治療胃腸道疾病的要穴，同時足三里為強(qiáng)壯穴，可滋后天生化之源以養(yǎng)先天。選取足厥陰肝經(jīng)原穴太沖可疏郁結(jié)之肝氣，調(diào)暢氣機(jī)。二者配合以達(dá)健脾疏肝，通暢胃腑之功。

CRF家族中有CRF配體（CRF、Ucn1、Ucn2等）及CRF受體（CRF-R1、CRF-R2），其通過配體受體結(jié)合發(fā)揮多種效應(yīng)。CRF是由41個氨基酸組成的重要神經(jīng)內(nèi)分泌肽，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（如下丘腦）及外周組織（如胃腸道），在下丘腦室旁核表達(dá)較高［13］。CRF調(diào)控多種神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等反應(yīng)，通過激活促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體（CRFR），在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面均發(fā)揮重大作用，能調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌、炎性反應(yīng)、行為及精神改變等［14］，是機(jī)體重要的神經(jīng)遞質(zhì)。CRF發(fā)揮其生理作用主要是通過與其受體結(jié)合而實現(xiàn)的，CRF受體中CRF-R1、CRF-R2具有生物學(xué)活性，參與CRF的大部分生物效應(yīng)［15］。腦內(nèi)CRF主要與CRF-R1結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)，CRF-R1在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，通過調(diào)控丘腦-垂體-腎上腺軸而調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素的分泌［14］，CRF-R2主要在外周分布，參與調(diào)控機(jī)體能量平衡［16］。研究表明，CRF-R1具有促進(jìn)焦慮、抑郁發(fā)生作用，而CRF-R2具有抗焦慮抑郁作用［17］。

本研究進(jìn)行曠場實驗，從行為學(xué)角度評價各組大鼠焦慮抑郁情況；另外采用Western blotting檢測大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2表達(dá)，從蛋白水平評價電針干預(yù)下FD大鼠的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，電針干預(yù)后大鼠水平運動格數(shù)、垂直運動次數(shù)、中央格停留時間顯著增加，提示電針干預(yù)可減輕大鼠焦慮抑郁狀態(tài)。大鼠下丘腦CRF、CRF-R1表達(dá)降低而CRF-R2表達(dá)升高，提示電針干預(yù)可調(diào)節(jié)CRF及其受體的平衡。因此，根據(jù)本實驗結(jié)果所示，電針可能是通過下調(diào)下丘腦CRF、CRF-R1，上調(diào)CRF-R2來減輕大鼠焦慮樣行為治療FD，且CRF-R1、CRF-R2之間的平衡與FD發(fā)病相關(guān)，從心理及精神因素角度揭示FD發(fā)病機(jī)制及電針療法對FD的作用機(jī)制。本課題組下一步會阻斷CRF受體，開展觀察大鼠焦慮樣行為是否變化等一系列實驗來進(jìn)一步探究電針治療FD的機(jī)制。