馬藝戈, 王冰蕊, 高潔, 劉金花, 佟靜媛, 劉麗君, 石莉紅*

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所), 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 天津 300020;2.東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院, 沈陽 110169

細(xì)胞周期是精細(xì)有序的生物學(xué)過程，間期和分裂期兩個階段分工明確地合作，完成一次完整的細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的正確連續(xù)進(jìn)行不僅在細(xì)胞生物學(xué)層面對于生長發(fā)育意義重大，而且在病理生理狀態(tài)下對于癌癥的發(fā)病機(jī)制和治療機(jī)理的研究至關(guān)重要[1]。細(xì)胞周期在正常的造血進(jìn)程中對造血干細(xì)胞的自我更新和造血祖細(xì)胞的譜系定向分化進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控[2]。在血液系統(tǒng)疾病如骨髓增生異常綜合征中，細(xì)胞周期紊亂造成的細(xì)胞非正常增殖是它的重要生物學(xué)特征[3]。在一個完整的細(xì)胞周期過程中，DNA合成前期(G1期)至DNA合成期S期、DNA合成后期(G2期)至分裂期(M期)這兩個階段由于DNA含量的變化致使細(xì)胞周期呈高活躍狀態(tài)，受到細(xì)胞內(nèi)檢測點(diǎn)調(diào)控[4]。因此這兩個階段的長度及比例，對于研究正常及異常的細(xì)胞周期狀態(tài)都有重要意義。

細(xì)胞周期的比例為所處細(xì)胞周期階段的細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞量的比例。而細(xì)胞周期的總倍增時間及各期的時間長度為完成一次完整細(xì)胞周期所需的總時間和在各期所用的時間長短。因此，各期所占細(xì)胞周期的比例為細(xì)胞周期變化的相對值，細(xì)胞周期的倍增時間及各期長度為細(xì)胞周期變化的絕對值。

人慢性髓系白血病K562細(xì)胞是從慢性粒細(xì)胞白血病患者中提取的細(xì)胞系，它是研究譜系定向分化的細(xì)胞模型，與未分化的早期多潛能的造血祖細(xì)胞相近，具有多向分化的潛能，可由血紅素氧化后的產(chǎn)物Hemin誘導(dǎo)紅系分化[5-8]。本研究首先利用BrdU與7-AAD雙染的方法檢測了Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞對其細(xì)胞周期相對值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)紅系分化的K562細(xì)胞并未改變細(xì)胞周期的相對值。因此，利用BrdU間隔染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的方法，通過分析BrdU陽性(標(biāo)記BrdU染料)的細(xì)胞隨著時間間隔增加(0、1、2、…、12 h)的變化情況，檢測Hemin誘導(dǎo)的K562紅系分化細(xì)胞對其細(xì)胞倍增時間及各期時長的影響，從而在細(xì)胞周期變化的相對值和絕對值兩方面，研究K562細(xì)胞紅系分化后對細(xì)胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀LSR-II(BD);Shandon Cytospin4 細(xì)胞離心涂片機(jī)(Thermo Scientific);K562細(xì)胞株購自美國ATCC細(xì)胞庫;Hemin粉末、o-Dianisidine粉末購自Sigma公司;甲醇、無水乙醇購自天津市船化學(xué)試劑科技有限公司;PBS緩沖液購自Hyclone公司;BrdU-FITC檢測試劑盒購自BD公司;細(xì)胞培養(yǎng)及凍存試劑：胎牛血清、L-谷氨酰胺、RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素抗生素等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Gibco公司; 二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配方為：10%胎牛血清、青霉素(100 U·mL-1)-鏈霉素抗生素(100 μg·mL-1)、L-谷氨酰胺(2 mmol·L-1)。K562細(xì)胞紅系分化由30 μmmol·L-1Hemin誘導(dǎo); K562細(xì)胞及誘導(dǎo)紅系分化的K562細(xì)胞置于恒溫37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱; K562細(xì)胞培養(yǎng)密度為2×105個·mL-1。

1.3 計數(shù)法統(tǒng)計細(xì)胞存活率

10 μL細(xì)胞與10 μL臺盼藍(lán)于EP管中混勻，顯微鏡下記錄活細(xì)胞數(shù)(臺盼藍(lán)未染色細(xì)胞)。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 聯(lián)苯胺染色及觀察

細(xì)胞甩片：收集4×104個細(xì)胞，70 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞離心涂片機(jī)甩片;聯(lián)苯胺染色：玻片浸入甲醇染缸固定4 min，轉(zhuǎn)移至聯(lián)苯胺染液避光染色2 min(聯(lián)苯胺染液：50 mL甲醇+0.5 g o-Dianisidine粉末;4 ℃避光保存)，轉(zhuǎn)移至過氧化氫溶液避光染色1.5 min(過氧化氫溶液：25 mL無水乙醇+25 mL去離子水+1.5 mL過氧化氫;現(xiàn)用現(xiàn)配)，轉(zhuǎn)移至去離子水，洗滌30 s。

利用顯微鏡觀察，對照組K562細(xì)胞與30 μmol·L-1Hemin誘導(dǎo)第3天的K562細(xì)胞聯(lián)苯胺染色后的形態(tài)及顏色。

1.5 BrdU間隔染色方法

試劑準(zhǔn)備及稀釋：Staining Buffer由無菌PBS緩沖液、0.2%牛血清白蛋白、0.08%葡萄糖配制。無菌PBS緩沖液將BrdU-FITC試劑盒中10×Perm Wash Buffer稀釋至1×工作液。

標(biāo)記染料及凍存：將1份K562細(xì)胞分成13組，分別加入75 μmol·L-1BrdU染料，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，收集細(xì)胞，離心，棄上清，并用無菌PBS緩沖液洗滌染料，更換新鮮培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，分別間隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h，收集各組時間間隔細(xì)胞，離心，棄上清并用無菌PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，200 μL Cytofix/Cytoperm Buffer(BrdU-FITC試劑盒)固定細(xì)胞，避光置于冰上孵育15 min，1×Perm Wash Buffer洗，90%胎牛血清+10%DMSO制成凍存液，將細(xì)胞凍存于-80℃。

復(fù)蘇及標(biāo)記抗體：復(fù)蘇細(xì)胞，1 mL Staining Buffer洗滌細(xì)胞，離心，棄上清，100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer固定細(xì)胞，避光置于冰上孵育10 min，1×Perm Wash Buffer和PBS緩沖液依次洗滌細(xì)胞，加入100 μL由300 μg·mL-1DNase I、1 μmol·L-1CaCl2和5 μmol·L-1MgCl2制成的混合液，37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液洗滌3遍，室溫避光標(biāo)記BrdU-FITC抗體30 min，1 mL Staining Buffer洗滌抗體，標(biāo)記7-AAD，室溫避光10 min，LSR-II流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo 7.6.1軟件分析。

1.6 BrdU間隔染色的分析方法

通過分析細(xì)胞于各組不同時間間隔的流式結(jié)果，可見隨著時間增加，BrdU+與7-AAD+細(xì)胞群呈動態(tài)變化，從而依次判斷G2/M、S、G0/G1期時長。DNA含量由7-AAD分成2N、2N-4N及4N三部分，DNA含量為2N的細(xì)胞屬于G0/G1期，2N-4N的細(xì)胞屬于S期，4N的細(xì)胞屬于G2/M期。BrdU染料孵育1 h，BrdU染料摻入細(xì)胞周期S期，此時直接收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)操作，即為間隔0 h。若更換培養(yǎng)基并放入孵箱培養(yǎng)，間隔數(shù)小時后收集細(xì)胞。間隔時間段內(nèi)，此群BrdU+細(xì)胞繼續(xù)參與細(xì)胞周期。隨間隔時間的延長，依次進(jìn)入G2/M期、分裂后的子代細(xì)胞G0/G1期及子代細(xì)胞S期。

間隔Xh后，流式圖中出現(xiàn)子代細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞，即表示BrdU染料孵育結(jié)束時，有部分細(xì)胞即將結(jié)束S期并隨即進(jìn)入G2/M期，經(jīng)過Xh間隔，這部分細(xì)胞完成了G2/M期，開始進(jìn)入子代G0/G1期，那么Xh即為細(xì)胞經(jīng)歷G2/M期所用時間長度。

間隔Yh后，流式圖中2N-4N細(xì)胞完全消失，只剩2 N和4 N的細(xì)胞，即表示BrdU染料孵育結(jié)束時，有部分細(xì)胞即將進(jìn)入S期。經(jīng)過Yh間隔后，這部分細(xì)胞完成了S期，開始全部進(jìn)入G2/M期甚至子代G0/G1期，那么Yh即為細(xì)胞經(jīng)歷S期所用時間長度。

間隔Zh后，子代G0/G1期細(xì)胞從2N向2N-4N遷移，即表示子代細(xì)胞完成G0/G1期，開始進(jìn)入S期。因已知細(xì)胞進(jìn)入子代G0/G1期的時間間隔約為Xh，那么(Z-X)即為細(xì)胞經(jīng)歷G0/G1期所用時間長度。

由此，根據(jù)間隔0～12 h的流式圖，可計算出G0/G1、S、G2/M期及細(xì)胞周期倍增時長[9-11]。

1.7 BrdU與7-AAD雙染檢測細(xì)胞

將通過無菌的PBS緩沖液稀釋的BrdU稀釋液加入細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h。PBS洗滌細(xì)胞后，100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer重懸細(xì)胞，室溫放置15 min。1×Perm Wash Buffer洗滌細(xì)胞后，100 μL Cytoperm/Permeabilization Buffer(BrdU-FITC試劑盒)重懸細(xì)胞，置于冰上10 min。1×Perm Wash Buffer洗滌細(xì)胞，100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer重懸細(xì)胞，置于冰上5 min。1×Perm Wash Buffer洗滌細(xì)胞，棄上清，加入100 μL 300 μg·mL-1DNase I重懸細(xì)胞，37 ℃孵育1 h。1×Perm Wash Buffer洗滌細(xì)胞，棄上清加入2 μL BrdU抗體，室溫孵育40 min。1×Perm Wash Buffer洗滌細(xì)胞，棄上清加入10 μL 7-AAD染料，室溫放置10 min。LSR-II流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo 7.6.1軟件分析。

1.8 生長曲線法計算倍增時間

利用生長曲線公式法推測K562細(xì)胞倍增時間，公式為Td=T0×lg2/(lgNt-lgN0)。其中Td為倍增時間，T0為間隔時間,Nt為對數(shù)生長期任意時間點(diǎn)的觀察值，N0為對數(shù)生長期任意時間點(diǎn)的初始值[12]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6制作圖表和統(tǒng)計學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)大于3次。配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化

利用30 μmol·L-1Hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化72 h后，在顯微鏡下可見聯(lián)苯胺染色結(jié)果(圖1A-B)，聯(lián)苯胺染色陽性的細(xì)胞比例約為30%(圖1C)。Hemin 是血紅素氧化產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)與血紅素相似，含有高價鐵卟啉能夠誘導(dǎo)血紅蛋白表達(dá)，因此聯(lián)苯胺染色為陽性[13]。由此，Hemin成功誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化。

A:對照組(×40);B:Hemin處理組(×40);C:Hemin誘導(dǎo)的K562紅系分化的細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽性比例。**表示數(shù)據(jù)與對照相比在P<0.01差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 BrdU-7AAD雙染檢測Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞周期相對值變化

通過BrdU-7AAD雙染色法檢測細(xì)胞周期各時期比例，判斷其相對值的變化情況。如圖2所示，K562細(xì)胞周期中S期占細(xì)胞周期的比例約為49.7%，G0/G1期占細(xì)胞周期的比例約為45.6%，G2/M期占細(xì)胞周期的比例約為4.6%(圖2A)。Hemin誘導(dǎo)的K562紅系分化細(xì)胞的細(xì)胞周期中S期占細(xì)胞周期的比例約為53.9%，G0/G1期占細(xì)胞周期的比例約為40.6%，G2/M期占細(xì)胞周期的比例約為4.62%(圖2B)。Hemin誘導(dǎo)K562紅系分化的細(xì)胞周期不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2C)。由此，Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞未改變其細(xì)胞周期相對值。

A:未誘導(dǎo)的K562細(xì)胞周期各期比例;B:Hemin處理組細(xì)胞周期各期比例;C:Hemin誘導(dǎo)K562紅系分化對細(xì)胞周期各期比例的影響。NS表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 利用生長曲線法推測K562細(xì)胞倍增時間

Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞對細(xì)胞周期各期比例變化沒有明顯的影響。因此，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計活細(xì)胞數(shù)目，繪制K562細(xì)胞對數(shù)期生長曲線(圖3)，發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞呈對數(shù)增長。K562細(xì)胞對數(shù)生長期中，利用臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞存活率約為99%(圖4)。連續(xù)5 d在K562的新鮮培養(yǎng)基中種2×105個細(xì)胞，觀察其經(jīng)過24 h增殖后的細(xì)胞數(shù)目，并利用生長曲線公式法Td=T0lg2/(lgNt-lgN0)，推測出K562細(xì)胞倍增時間約為20.229 h(表1)。由于K562細(xì)胞是永生化細(xì)胞系,存活率較高，通過多時間點(diǎn)細(xì)胞計數(shù)繪制生長曲線，計算細(xì)胞周期的倍增時間的方法可以降低細(xì)胞計數(shù)法誤差帶來的干擾，結(jié)果可信度較高。

表1 生長曲線公式法推測K562倍增時間Table1 K562 doubling time by growth curve formula method

圖4 K562細(xì)胞存活率Fig.4 K562 cells viability

圖3 K562細(xì)胞生長曲線Fig.3 K562 cells growth curve

2.4 間隔染色檢測K562細(xì)胞倍增時間及細(xì)胞各期時長

利用BrdU間隔染色結(jié)合流式分析的方法，檢測K562紅系分化細(xì)胞周期絕對值的變化情況?？梢婋S著間隔時間的增加,未誘導(dǎo)的K562細(xì)胞呈階段式變化。0 h BrdU與7-AAD雙染的流式圖S期、G0/G1期和G2/M期呈明顯的3群。間隔時間增加，BrdU+的細(xì)胞群2N處的細(xì)胞逐漸向4 N處偏移。4 h時，BrdU+細(xì)胞群在2 N處出現(xiàn)一小群細(xì)胞，代表BrdU+進(jìn)入了子代細(xì)胞。由此，推算出G2/M期的時長為4 h。接下來，可見BrdU+細(xì)胞在2N處的細(xì)胞群逐漸積累，直至間隔時間為9 h，2N與4N之間的細(xì)胞群消失，此時代表S期結(jié)束,即S期的時長為9 h。在11 h時，BrdU+細(xì)胞在2 N處的細(xì)胞群開始從2 N向2N-4N遷移，即代表進(jìn)入到新的S期，G0/G1期的結(jié)束，那么G0/G1期的時長為11 h減去4 h，即為7 h。綜上所述，通過流式圖中，BrdU+細(xì)胞的動態(tài)變化過程，我們推算出了G2/M期約為4 h，S期約為9 h，G0/G1期約為7 h，故倍增時間約為20 h(圖5)。BrdU間隔染色測定分析K562倍增時間的方法與利用生長曲線公式法推測倍增時間相符，證明了BrdU間隔染色技術(shù)方法的準(zhǔn)確性。

A：K562細(xì)胞BrdU 間隔染色流式圖;B：K562細(xì)胞倍增時間及各期時長

2.5 Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞的倍增時間及各期時長

利用BrdU間隔染色，對Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞的倍增時間和各期時長進(jìn)行了流式分析，可見Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞隨著時間間隔的增加，BrdU+細(xì)胞也具有動態(tài)的變化規(guī)律。當(dāng)間隔時間為0 h， BrdU與7-AAD雙染的流式圖呈明顯的3群。隨著間隔時間增加至5 h，BrdU+細(xì)胞群在2N處出現(xiàn)一小群細(xì)胞，推算出G2/M期的時長為5 h。當(dāng)間隔時間為11 h時，BrdU+細(xì)胞群2N與4N之間的細(xì)胞完全消失，推算出S期的時長為11 h。當(dāng)間隔時間為12 h時，BrdU+細(xì)胞在2N處的細(xì)胞群開始從2N向2N-4N遷移，那么G0/G1期的時長為12 h減去5 h，即為7 h(圖6)。由此，通過流式圖中，我們推算出了Hemin誘導(dǎo)的K562紅系分化細(xì)胞G2/M期約為5 h，S期約為11 h，G0/G1期約為7 h，故倍增時間約為23 h。

未誘導(dǎo)的K562細(xì)胞總倍增時間約為20 h，S期的時長約為9 h；由Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞總倍增時間約為23 h，S期約為11 h。Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞倍增時間和各期時長與未誘導(dǎo)的K562細(xì)胞周期時長的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖6C)。因此，K562細(xì)胞誘導(dǎo)紅系分化進(jìn)程不影響其細(xì)胞周期總倍增時間和各期時間長短，即不影響細(xì)胞周期的絕對值。

A: Hemin誘導(dǎo)的K562分化細(xì)胞BrdU間隔染色流式圖; B: Hemin誘導(dǎo)的K562分化細(xì)胞倍增時間及各期時長; C: Hemin誘導(dǎo)K562分化細(xì)胞對細(xì)胞周期時間長度的影響(P>0.05)。

3 討論

利用體外培養(yǎng)的細(xì)胞系作為細(xì)胞模型，是研究體內(nèi)生物學(xué)發(fā)生過程的重要研究手段。人慢性髓系白血病K562細(xì)胞是研究紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞相關(guān)疾病和治療機(jī)理的重要體外細(xì)胞系模型，可通過特定條件誘導(dǎo)體外分化[14]。Hemin 是血紅素氧化產(chǎn)物，誘導(dǎo) K562 細(xì)胞紅系分化進(jìn)程，促進(jìn)了紅系轉(zhuǎn)錄因子 GATA-1 和 NF-E2 的表達(dá)，并且能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞中血紅蛋白表達(dá)[15]。

本研究利用聯(lián)苯胺染色確定Hemin成功誘導(dǎo)了K562細(xì)胞紅系分化。在Hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)紅系分化的K562細(xì)胞并未改變細(xì)胞周期G0/G1期、S期和G2/M期三期的比例，即細(xì)胞周期相對值無明顯變化。本研究首次將BrdU間隔染色這一技術(shù)應(yīng)用到了K562細(xì)胞系的倍增時間和各期時長的測量中，該技術(shù)通過普及性較高且操作人性化的流式細(xì)胞術(shù)，分析不同時間間隔BrdU與7-AAD雙染的細(xì)胞群的動態(tài)變化，從而檢測K562細(xì)胞的倍增時間和各期時長，其結(jié)果同生長曲線法結(jié)果一致。這一技術(shù)準(zhǔn)確性較高，且無需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)操作即可從圖像中直觀判斷出細(xì)胞周期各期時長和細(xì)胞周期總倍增時間。同時，應(yīng)用該方法檢測了Hemin誘導(dǎo)紅系分化的K562細(xì)胞對細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)Hemin誘導(dǎo)紅系分化的K562細(xì)胞對細(xì)胞周期倍增時間和各期時長無明顯作用。綜上，結(jié)合細(xì)胞周期相對值和絕對值的檢測結(jié)果，Hemin誘導(dǎo)K562紅系分化未對細(xì)胞周期造成明顯影響。