楊曉菲，王長有，陳春環(huán)，田增榮，吉萬全

(1.渭南師范學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,陜西渭南 714099; 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

賴草屬(LeymusHochst.)是一個從四倍體至十二倍體類型均有的多倍體物種，其中許多物種[如大賴草(L.racemusus)、羊草(L.chinensis)、多枝賴草(L.multicaulis)等]的染色體核型已經(jīng)非常清楚[1-2]，而濱麥(Leymusmollis)是賴草屬中的一個四倍體物種，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿[3]、莖稈粗壯和大穗[4]等優(yōu)良性狀，同時對小麥條銹病、葉銹病和白粉病等多種真菌病害免疫[5-6]。作為小麥改良育種的重要三級基因資源[7]，其染色體核型的研究處于空白狀態(tài)，且四倍體賴草屬植物基因組(染色體組)構(gòu)成目前尚未定論。濱麥基因組為NsNsXmXm，其中Ns基因組來自于新麥草(PsathyrostachysKeng)[8-10]，而Xm基因組的來源目前尚未確定。在第2屆國際小麥族研討會上(1994年美國猶他州)，基因組命名委員會建議使用NsXm作為四倍體賴草屬植物基因組的表示符號，Xm代表一個未知的基因組直到試驗驗證為止[11]。

染色體組型分析可以初步判斷外源染色體是否存在和具體數(shù)目，是植物分類和遺傳研究的重要方法之一。本研究對濱麥染色體核型進行初步分析并繪制濱麥染色體核型模式圖，同時通過分子標記研究其可能的二倍體供體種并分析其與濱麥之間的親緣關(guān)系。

Pedersen等[12]利用FISH技術(shù)結(jié)合重復(fù)序列pAsl和pHvG38，分辨出中國春和綿陽11中的21對染色體。由于重復(fù)序列探針的準備耗時費力，部分寡核苷酸探針的發(fā)展為辨別染色體提供了一種更經(jīng)濟高效的方法。Tang等[13]研究認為，兩種寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535代替重復(fù)序列pAsl和pHvG38做雙色FISH，同樣可以清晰準確地識別小麥21對染色體。因此，本研究擬結(jié)合兩種寡核苷酸探針對普通小麥7182的標準核型進行繪制，并利用FISH-GISH技術(shù)對普通小麥-濱麥高世代衍生系的染色體組成進行分析，旨在為后續(xù)創(chuàng)制和鑒定出更多類型的普通小麥-濱麥種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料包括普通小麥7182(Triticumaestivum，2n=6x=42，AABBDD)，濱麥(L.mollis，2n=4x=28，NsNsXmXm)，華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica，2n=2x=14，NsNs)，二倍體長穗偃麥草(Thinopyrumelongatum，2n=2x=14，EeEe)，擬鵝觀草(Pseudoroegeriaspicata，2n=2x=14,StSt)和百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum，2n=2x=14，EbEb)以及普通小麥-濱麥高世代衍生系M47和M39。

1.2 試驗方法

1.2.1 根尖培養(yǎng)與取材

將供試材料種子腹溝朝下，置于鋪有兩層濾紙的干凈培養(yǎng)皿中，加ddH2O濕潤濾紙即可(無多余的水分流動為宜)。將培養(yǎng)皿置于23～25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待根長至3～5 cm時，剪取長約1 cm根尖放入濕潤且打孔的普通離心管(1.5 mL)中并編號記錄，放入笑氣(N2O)罐中密封處理2 h，之后在離心管中加入300 μL 90% 冰乙酸，冰浴固定10 min后，ddH2O沖洗根尖3次，靜置，待離心管完全干燥后，加入70% 冰乙醇，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

濱麥根尖于2015-2017連續(xù)三年在3月下旬至4月上旬取材兩到三次，挖取新生根并剪取約1 cm長的根尖，置于冰水混合物中處理22～26 h，然后用卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1，v/v)于4 ℃冰箱固定48 h左右，用ddH2O將根尖沖洗至少3次，隨后加入70%冰乙醇，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根尖處理與制片

用ddH2O沖洗70%冰乙醇保存的根尖，用濾紙吸干水分，切取乳白色根尖部分置于裝有2% 纖維素酶和1%果膠酶混合酶液的0.5 mL離心管中，瞬時離心，待乳白色根尖沉入離心管底部，將離心管放入37 ℃水浴酶解55～60 min(不同材料酶解時間有所不同)。然后用70% 乙醇沖洗三次，用解剖針將浸潤在100 μL 70% 乙醇中的根尖搗碎，6 000 r·min-1離心1～2 min，倒置離心管于濾紙上吸干水分，加40 μL預(yù)冷的純乙酸，高速瞬時渦旋3次，移液槍吸取10 μL懸濁液滴于干凈載玻片上(處于黑暗且濕潤的盒子)，5 min后待懸濁液緩慢均勻擴散后于顯微鏡下鏡檢并拍照。

1.2.3 染色體核型分析與模式圖繪制

根據(jù)李懋學(xué)等[14]關(guān)于植物核型的分析標準，選取30個以上染色體形態(tài)和分散較好的中期分裂相細胞進行染色體數(shù)目的統(tǒng)計，精選五個細胞進行拍照。利用圖象處理軟件Adobe Photoshop CS6進行細胞背景處理，測量各個染色體及各臂的相對長度，進行染色體的配對，排列建立核型圖。

利用Excel對染色體的各種參數(shù)進行數(shù)據(jù)分析，并繪制出整套染色體的核型模式圖。按照Stebbins[15]的核型標準進行核型分類。

1.2.4 SSR和EST分子標記分析

分子標記分析共選用825對SSR引物和86對EST引物，SSR和EST引物序列均來自GrainGenes數(shù)據(jù)庫(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)，由奧科鼎盛生物科技有限公司(北京)合成。采用改良后的CTAB法對供試材料進行總基因組DNA的提取。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括1.0 μL PCR Buffer 緩沖液(含Mg2+)、1.0 μL 0.5 μmol·L-1primers(正、反向引物各0.5 μL)、0.8 μL 0.2 mmol·L-1dNTPs混合液、模板DNA 1.0 μL(200 ng·μL-1)、0.1 μL Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)，ddH2O補充至 10.0 μL。反應(yīng)在熱循環(huán)儀Bio-Rad S1000TM型(California,USA)上進行。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，電泳步驟參照吳金華等[16]的方法，凝膠經(jīng)硝酸銀染色顯影后置于燈箱上觀察、照相并統(tǒng)計帶型。

1.2.5 雙色FISH-GISH技術(shù)

參照Tang 等[13]的方法，利用英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司(上海)合成的兩種寡核苷酸探針Oligo-pTa535(Tamra-red)、Oligo-pSc119.2(FAM-green)序列，以及濱麥葉片總基因組DNA為探針，先后對根尖體細胞進行熒光原位雜交(FISH)和基因組原位雜交(GISH)分析。濱麥葉片gDNA的提取參照改良后的CTAB法[17]進行。使用OLYMPUS BX53(日本)熒光顯微鏡鏡檢，利用系統(tǒng)軟件DP800 CCD、cellSens Standaed 1.8進行拍照并用圖像處理軟件Adobe Photoshop CS6分析圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 濱麥染色體核型分析及核型模式圖

鏡檢結(jié)果表明，濱麥根尖的細胞染色體數(shù)目為28條，即2n=4x=28(圖1a)。利用圖像處理軟件Adobe Photoshop CS6對染色體及各臂的相對長度進行測量，根據(jù)測量結(jié)果進行配對和排序，繪制濱麥染色體核型圖(圖1b)。計算染色體長臂與短臂相對長度的比值并確定每一對染色體所屬類型(表1)，繪制出濱麥染色體核型模式圖(圖1c)。依據(jù)核型標準推測出濱麥的核型公式為：2n=4x=28=22m(6sat)+6sm，其中m、sm和sat分別代表中間著絲粒染色體、亞中間著絲粒染色體和具有隨體的染色體。

2.2 濱麥染色體核型的歸屬

根據(jù)濱麥各對染色體的臂比(表1，圖1c)，發(fā)現(xiàn)中間著絲粒染色體和亞中間著絲粒染色體分別有11對和3對。依據(jù)Stebbins[15]的染色體核型標準分類方案，即最長與最短染色體之間的長度比值<2記為A級，比值在2～4之間記為B級，比值>4記為C級；臂比(長臂/短臂)>2的比例為0記為I級，0.01～0.5記為II級，0.51～0.99記為Ⅲ級，1.0記為Ⅳ級。本研究中濱麥最長和最短染色體的比值為1.98，記為A級；染色體臂比>2的比例為0.07，記為II級。因此，濱麥染色體的核型類型為IIA。

箭頭指示濱麥染色體的隨體。

表1 濱麥染色體的相對長度(總長、長短臂)、臂比及類型

2.3 濱麥染色體組供體種的初步分析

分子標記擴增結(jié)果表明，456對標記(包括379對SSR引物和77對EST引物)在二倍體華山新麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、擬鵝觀草和四倍體濱麥中表現(xiàn)多態(tài)性(部分結(jié)果如圖2)，58對標記在濱麥和四種二倍體物種中擴增帶型完全一致，其余311對標記在濱麥、華山新麥草、二倍體長穗偃麥草、擬鵝觀草和百薩偃麥草中無擴增條帶或者擴增條帶模糊。濱麥染色體組供體種分子標記的初步分析結(jié)果表明，在多態(tài)性標記中有157對SSR標記和27對EST標記在華山新麥草和濱麥間擴增出相同帶型；有52對SSR標記和15對EST標記在百薩偃麥草和濱麥間擴增出相同帶型；有62對SSR標記和21對EST標記在二倍體長穗偃麥草和濱麥間擴增出相同帶型；有67對SSR標記和24對EST標記在擬鵝觀草和濱麥間擴增出相同帶型。這說明華山新麥草、百薩偃麥草、二倍體長穗偃麥草和擬鵝觀草與濱麥擴增出相同帶型的標記分別占多態(tài)性標記數(shù)的40.35%、14.69%、18.20% 和19.96%。

a:Xgpw7574-5B標記的PCR結(jié)果；b:Xgwm674-3A標記的PCR結(jié)果；M:Marker；1:濱麥；2:華山新麥草；3:百薩偃麥草；4:二倍體長穗偃麥草；5:擬鵝觀草。

2.4 普通小麥7182的FISH標準核型圖

傅 杰等[18]通過組織培養(yǎng)獲得普通小麥-濱麥的雜種F1植株，經(jīng)秋水仙素處理后與普通小麥品系7182回交獲得了雜種后代。本研究結(jié)合兩種寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535，采用雙色FISH技術(shù)繪制出普通小麥7182所有染色體的FISH標準核型圖(圖3)。

紅色：Oligo-pTa535探針；綠色：Oligo-pSc119.2探針；藍色：DPAI復(fù)染。

2.5 普通小麥-濱麥高世代衍生系M47和M39的染色體組成

利用寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535對高世代衍生系M47和M39進行順序雙色FISH-GISH鑒定。細胞學(xué)觀察結(jié)果表明，M47和M39體細胞染色體數(shù)目均為56條，不同的是，M47中有42條普通小麥染色體，14條雙末端紅色信號染色體(圖4a)；而M39中有44條普通小麥染色體，其中包含4條4B小麥染色體，僅有12條雙末端紅色信號染色體(圖5a)，因此，初步推斷雙末端紅色信號染色體為濱麥染色體。為了進一步確認雙末端紅色染色體的來源，利用濱麥的總基因組DNA為探針進行GISH鑒定，結(jié)果表明，雙末端紅色信號染色體為濱麥染色體(圖4b、5b)。

a：利用寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對M47的FISH分析，顯示42條小麥染色體(已標出)及14條雙末端紅色信號染色體(白色箭頭所指)；b:利用濱麥總基因組DNA 為探針(綠色)在同一張片子上對M47的GISH分析。以DAPI為復(fù)染劑(藍色)。

a:利用寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對M39的FISH分析，顯示44條普通小麥染色體(已標出)包含4條4B染色體(白色大箭頭所指)及12條雙末端紅色信號染色體(白色小箭頭所指)；b:利用濱麥總基因組DNA 為探針(綠色)在同一張片子上對M39的GISH分析。DAPI為復(fù)染劑(藍色)。

3 討 論

3.1 濱麥核型及染色體組構(gòu)成分析

智 力[19]于2000年報道了窄穎賴草(L.angustus)、粗穗賴草(L.crassiuculus)、若羌賴草(L.ruoqiangensis)、大賴草(L.ruoqiangensis)和羊草(L.chinensis)等5個不同賴草屬物種的染色體核型；楊瑞武等[1]于2004年報道了十一個賴草屬四倍體物種，包括多枝賴草(L.multicaulis)、分枝賴草(L.ramosus)、沙生賴草(L.arenarius)、鹽生賴草(L.salinus)、密穗賴草(L.condensatus)、新生賴草(L.innovatus)、灰賴草(L.cinereus)、柴達木賴草(L.pseudoracemosus)、無芒賴草(L.triticoides)、阿克摩林賴草(L.akmolinensis)及賴草(L.secalinus)的染色體核型。分析比較得知，上述賴草屬不同物種均具有隨體染色體，且多數(shù)為中部著絲粒染色體，每個物種具有數(shù)量不等的近中部著絲粒染色體，其中個別物種還有少數(shù)的近端部著絲粒染色體。從核型的分類類型來看，除多枝賴草和沙生賴草核型為IIB外，其余物種的核型均為IIA。而葛榮朝等[20]發(fā)現(xiàn)，多枝賴草染色體核型中未出現(xiàn)隨體染色體，這與楊瑞武[1]的研究結(jié)果不一致，造成結(jié)果差異的原因可能與試驗材料來源和所采用的試驗方法不同以及試驗操作過程中的誤差等有關(guān)。

本研究對四倍體濱麥進行了核型分析，核型公式為2n=4x=28=22m(6sat)+6sm，核型類型為ⅡA，可以得出具有隨體的濱麥染色體以中部著絲粒染色體為主，有少數(shù)的近中部著絲粒染色體，這與前人報道的賴草屬大多數(shù)物種的核型相似。綜合分析，賴草屬不同物種的染色體核型既有相似之處，也有各自的特征差異，這種差異可以作為物種基礎(chǔ)分類的細胞學(xué)依據(jù)。多態(tài)性分子標記在華山新麥草、百薩偃麥草、二倍體長穗偃麥草和擬鵝觀草與濱麥擴增出相同帶型的不同比例初步表明，華山新麥草與濱麥的親緣關(guān)系較其他三個供體種更近。

3.2 普通小麥7128標準核型及其與濱麥高世代衍生系的染色體組成

本研究利用兩種寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535代替耗時費力的重復(fù)序列pAsl和pHvG38，更加經(jīng)濟、高效和準確地繪制出普通小麥7182中21對染色體的標準FISH核型圖。通過雙色FISH-GISH技術(shù)鑒定出兩種類型的普通小麥-濱麥高世代衍生系M47(2n=56=42T.a+14L.m)和M39(2n=56=44T.a+12L.m)，均可作為創(chuàng)制新的普通小麥-濱麥種質(zhì)資源的中間橋梁材料。本研究為后續(xù)普通小麥-濱麥種質(zhì)資源的創(chuàng)制和鑒定提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)和技術(shù) 方法。