晉文慧，陳暉，張怡評，方華，陳偉珠，洪專

（1.自然資源部第三海洋研究所，福建廈門 361005； 2.華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建廈門 361021）

藻油是一種從海洋微藻中提取得到的天然保健食品，富含ω-3 系高度不飽和脂肪酸（PUFAs），主要包括二十二碳五烯酸（DPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等，以及低含量的二十碳五烯酸（EPA）。DPA 和DHA 都是人體所必需的脂肪酸，但在人體內(nèi)難以合成，主要來自于海洋魚類和微藻油，是理想的功效食品或營養(yǎng)品［1-4］。近年來大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，DPA，DHA 對維護(hù)人體健康有重要作用，具有調(diào)節(jié)血脂、軟化血管、降低血液粘度、改善視力、促進(jìn)生長發(fā)育和提高人體免疫功能等作用，其中DPA 能清除血液中的低密度膽固醇，預(yù)防因膽固醇過多積聚于血管壁而造成的動脈粥樣硬化［5-8］。目前，關(guān)于PUFAs 的研究多集中在DHA 和EPA，DPA 是DHA 和EPA 合成過程的重要中間物質(zhì)，因?yàn)檩^難獲得DPA 純凈物，且其價(jià)格昂貴，所以用純DPA 進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)非常少，DPA 還未被系統(tǒng)地研究過。

目前應(yīng)用的二十二碳五烯酸主要有甘油酯型、甲酯型和游離脂肪酸型。在上世紀(jì)90 年代，應(yīng)用于保健品的類型主要以甲酯型為主，主要的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法 等［8-12］，但迄今為止，國內(nèi)尚無研制二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的報(bào)道。為了支持國內(nèi)相關(guān)高校、研究所和生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行研究，進(jìn)行了二十二碳五烯酸甲酯國家標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備研究［13］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890 型，配FID 檢測器，美國安捷倫科技有限公司；

半制備色譜柱：SB-C18型，250 mm ×20 mm， 5 μm，

紅外光譜儀：VERTEX 70 型，德國布魯克公司；液質(zhì)聯(lián)用儀：3100 型，美國沃特世公司；

核磁共振波譜儀：400 MHz 型，德國布魯克公司；

甲醇、氫氧化鉀、硫酸、尿素、硝酸銀、無水硫酸鈉、丙酮，石油醚：分析純，沸程為60～90℃，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

正已烷：色譜純，美國飛世爾科學(xué)世界公司；硅膠：層析用，77～154 m，180℃烘干4 h，煙臺芝罘硅膠公司；

硝酸銀-硅膠層析柱：自制；

藻油粗品：廈門金達(dá)威有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二十二碳五烯酸甲酯的制備與分裝

以藻油粗品為原料，進(jìn)行皂化反應(yīng)、尿素包合分離、甲酯化、分子蒸餾，經(jīng)過硅膠-硝酸銀柱層析分離，提純得到二十二碳五烯酸甲酯粗品，使用SBC18（250 mm ×20 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司）半制備色譜柱，采用制備液相色譜技術(shù)精制，收集主峰流出液片段，將餾分純度高于99%的部分合并，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至溶劑揮干，再經(jīng)高真空泵石油醚三級油擴(kuò)散泵蒸干、殘余溶劑去除等過程，獲得高純二十二碳五烯酸甲酯單體［14-15］，于-18℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

在潔凈實(shí)驗(yàn)室中，對二十二碳五烯酸甲酯樣品進(jìn)行分裝與封裝。用1 mL 棕色安瓿瓶進(jìn)行充氮保護(hù)分裝，每瓶50 μL，用自動分液器分裝，高溫封口，共200 瓶，標(biāo)記為1～200#。分裝好的樣品置于-18℃冰箱中長期保存，有效期為2 年。

1.2.2 純度分析

制備質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL 的二十二碳五烯酸甲酯樣品溶液，采用氣相色譜法進(jìn)行測定，色譜峰面積歸一法進(jìn)行計(jì)算，對二十二碳五烯酸甲酯進(jìn)行純度分析［13］。

氣相色譜條件：DB-FFAP 型色譜柱（30 m×0.25 mm，0.2 μum，美國安捷倫科技有限公司），柱流量為1.0 mL／min；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μL，分流比為1∶10；程序升溫設(shè)置初始溫度100℃，保持5 min，以5℃／min 速率升至220℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度為260℃；檢測器溫度為270℃；載氣為高純氮，流量為1 mL／min，尾吹30 mL／min；燃燒氣為氫氣，流量為40 mL／min；助燃?xì)鉃榭諝?，流量?00 mL／min。

1.2.3 結(jié)構(gòu)分析

采用紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

紫外分析條件：以甲醇為溶劑，樣品溶液的濃度為0.5mg／mL，掃描范圍為200～400 nm；

紅外分析條件：采用KBr 壓片液膜法，波數(shù)范圍為370～7 500 cm-1，分辨率為0.4 cm-1，采樣速率為80 張／秒；

MS 分析條件：API 電離源，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，源溫度為120℃，脫溶劑溫度為350℃，脫溶劑氮?dú)饬髁繛?00 L／h，錐孔氮?dú)饬髁繛?0 L／h；

NMR 分析條件：溶劑為氘代氯仿（CDCl3），采集1H-NMR 譜和13C-NMR 譜圖。

1.2.4 均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)與定值研究

根據(jù)GB／T 15000.3-2008 《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》［16］進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性、均勻性檢驗(yàn)和定值［17-21］。

均勻性檢驗(yàn)：根據(jù)“隨機(jī)抽取的最小瓶數(shù)在10和30 之間，而且一般不應(yīng)少于10”的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)確定抽樣數(shù)目為15 個(gè)，按1.2.2 純度分析方法，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，以色譜峰歸一化法計(jì)算樣品的純度，采用單因素多水平試驗(yàn)方差分析法對二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，計(jì)算統(tǒng)計(jì)量F值，判斷樣品均勻性是否良好。

穩(wěn)定性檢驗(yàn)：對二十二碳五烯酸甲酯樣品在-18℃條件下，進(jìn)行24 個(gè)月的長期穩(wěn)定性考察。分別于0，6，12，18，24 個(gè)月月末取樣，每個(gè)樣品平行測定3 次，以色譜峰面積歸一化法計(jì)算樣品的純度值。采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察斜率值是否有顯著變化，預(yù)測二十二碳五烯酸甲酯的穩(wěn)定性變化。

定值：選擇8 家定值實(shí)驗(yàn)室，采用氣相色譜峰面積歸一法對二十二碳五烯酸甲酯進(jìn)行聯(lián)合定值。在1.2.2 氣相色譜分析條件下分別隨機(jī)取3 個(gè)樣品送檢，每個(gè)樣品平行測試2 次，8 家實(shí)驗(yàn)室每家提供6 個(gè)數(shù)據(jù)，對所有測試數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值和不確 定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備及分離純化

按照1.2.1 方法制備二十二碳五烯酸甲酯單體，制備液相色譜圖見圖1。從圖1 可知，主峰為二十二碳五烯酸甲酯，其保留時(shí)間為17.02 min，根據(jù)需要，收集主峰流出液，采用氣相色譜法進(jìn)行純度分析。

圖1 二十二碳五烯酸甲酯色譜圖

2.2 純度分析

收集液相色譜法精制后的二十二碳五烯酸甲酯主峰餾分片段，按照1.2.2 采用火焰離子化檢測器-氣相色譜法進(jìn)行純度分析，使用峰面積歸一法進(jìn)行計(jì)算。將純度高于99%的二十二碳五烯酸甲酯餾分進(jìn)行合并，經(jīng)過濃縮、抽干、殘余溶劑去除等過程，獲得高純二十二碳五烯酸甲酯單體。經(jīng)氣相色譜法分析檢測，二十二碳五烯酸甲酯純度為99.38%，氣相色譜圖見圖2。

圖2 二十二碳五烯酸甲酯氣相色譜圖

2.3 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

采用紅外、質(zhì)譜和核磁等方法對二十二碳五烯酸甲酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。紅外數(shù)據(jù)如下：3 012 cm-1為烯烴中=C—H 的伸縮振動，2 932 cm-1為烷烴CH3的不對稱伸縮振動，1 740 cm-1為酯鍵羰基的C=O 伸縮振動，1 171 cm-1為酯鍵的C—O—C 伸縮振動，710 cm-1為順式烯烴上C—H 的變形振動，為順式烯烴的特征峰。樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)說明結(jié)構(gòu)中存在碳碳雙鍵C=C、酯鍵、甲基以及順式碳碳雙鍵等基團(tuán)。該化合物分子式C23H36O2，相對分子質(zhì)量為344。測得的準(zhǔn)分子離子峰m／z345 ［M+H］+與其相對分子質(zhì)量相符。在質(zhì)譜圖中，除m／z345 外，還可以見到該化合物脫甲氧基（-O-CH3，31 u）的碎片峰（m／z313），與該化合物含甲氧基的結(jié)構(gòu)相符。樣品的核磁共振譜圖（1H NMR、13C NMR 等）所給出的結(jié)構(gòu)信息列于見表1，與化合物二十二碳五烯酸甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式（如圖3 所示）相符，確定該樣品為二十二碳五烯酸甲酯。

圖3 二十二碳五烯酸甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 二十二碳五烯酸甲酯的核磁共振數(shù)據(jù)（CDCl3，TMS）

2.4 均勻性檢驗(yàn)

按照1.2.4 中均勻性檢驗(yàn)方法要求，對15 個(gè)二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定，測定結(jié)果列于表2，采用方差分析法對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，分析結(jié)果列于表3。

表2 二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

表3 方差分析結(jié)果

根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，統(tǒng)計(jì)量F=1.868 1，瓶間方差SA2=-0.000 059，瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差ubb=0.01%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr=0.02%。經(jīng)查表可知，F(xiàn)(0.05，14，30)的值為2.04，F(xiàn)

2.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

按照1.2.4 中穩(wěn)定性檢驗(yàn)方法要求，分別于0，6，12，18，24 個(gè)月月末取樣，在相對濕度為(60±10)%、溫度為(-18±2)℃的條件下，按1.2.2 方法對樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算可得，長期試驗(yàn)穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)度即μlts=0.02%。長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品在低溫密閉環(huán)境下純度值基本恒定，說明二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品于-18℃條件下可穩(wěn)定保存24 個(gè)月。

2.6 定值結(jié)果

按照1.2.4 中定值檢驗(yàn)方法要求，選取8 家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行定值，定值數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果分別見表5、表6。

表5 定值結(jié)果 %

表6 定值方差分析結(jié)果 %

由表5 數(shù)據(jù)計(jì)算得二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為99.38%。

取包含因子k=1.96，則擴(kuò)展不確定度：

通過上述統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，確定了標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差sr為0.07%，復(fù)現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差sL為0.17%，二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值定值結(jié)果為(99.38±0.20)%（置信度為95%，k=1.96）。

3 結(jié)語

建立了二十二碳五烯酸甲酯的制備分離純化方法，制備得到二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，對其進(jìn)行了穩(wěn)定性、均勻性檢測以及定值，其定值結(jié)果為99.38 %，置信度95%的擴(kuò)展不確定度為0.20%。結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合國家標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)規(guī)范要求，最終通過國家標(biāo)樣委員會評審，成為國家級標(biāo)準(zhǔn)樣品。所研制的二十二碳五烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品填補(bǔ)了國內(nèi)該領(lǐng)域研究的空白，不僅滿足藻類及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測、質(zhì)量控制工作的需求，也為檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性以及溯源性提供了技術(shù)支撐。