杜 洋， 邵淑麗,2△， 焦凱賀， 劉祥露， 馮 元， 張偉偉,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目前，胃癌(gastric carcinoma, GC)是致死率極高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。胃癌在不同的時(shí)期治療的手段也各不相同，但大多的治療方式還是以外科手術(shù)為主，輔以放、化療和藥物治療等綜合治療[2]。盡管伴隨著我國(guó)診療科學(xué)的高速發(fā)展，但還是有大約90%以上的胃癌患者在接受外科手術(shù)治療后死于術(shù)后復(fù)發(fā)[3]。而化療則有一些不同，可以在一定程度上提高患者的生存率，但常規(guī)的化療藥物化療后會(huì)出現(xiàn)臨床上的不適癥狀和生物免疫功能降低的情況[4]。因此, 尋找環(huán)保、毒副作用小和治療胃癌效果明顯的藥物成為研究工作的重點(diǎn)。白花蛇舌草最早被記載于《廣西中藥志》中，隸屬于茜草科耳草屬，一年生披散草本植物[5]。白花蛇舌草的化學(xué)成分中含有多種抗腫瘤的相關(guān)成分, 而這些成分則主要通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6]、抑制腫瘤組織血管及淋巴管生成[7]、調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路[8]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[9]、抗氧化[10]等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。然而關(guān)于白花蛇舌草對(duì)人胃癌 MKN-45細(xì)胞線粒體膜電位及相關(guān)基因表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此, 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR和Western blot等方法研究不同濃度藥物作用MKN-45細(xì)胞48 h后對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡相關(guān)基因的影響，為白花蛇舌草的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胃癌MKN-45細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。白花蛇舌草(注射液)購(gòu)自南通飛宇生物制品有限責(zé)任公司，其濃度為 1 g/L。優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自Gibico公司。UN1Q-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、全蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。Cytc、caspase3和caspase9抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司。兔抗、鼠抗二抗購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司、Power 2×SYBR real-time PCR premixture試劑盒均購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制

MNK-45細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的完全培養(yǎng)液中, 于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。白花蛇舌草(注射液)經(jīng)0.22 μm的濾器無(wú)菌過(guò)濾后, 配置成終濃度為20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草，按100 μl每管分裝, 放于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將人胃癌?xì)胞MNK-45分成4組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為含未加入白花蛇舌草的MNK-45細(xì)胞；3組實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為20、30、40 μg/ml白花蛇舌草的MNK-45細(xì)胞；各組在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位，qRT-PCR檢測(cè)Cytochrome C (Cyt c)、caspase3和caspase9基因的表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)Cytochrome C (Cyt c)、caspase3和caspase9蛋白的表達(dá)變化。

1.3 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

將爬片放入到6孔板中，接種MNK-45細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 分別加入終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草, 培養(yǎng)48 h后, 先用1 ml 4%多聚甲醛固定MNK-45細(xì)胞，再用濃度為0.5 μg/μl的吖啶橙200 μl在室溫條件下孵育3～5 min, 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化并拍照。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位

收集終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理48 h后的人胃癌MNK-45細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于500 μl稀釋好的Rho-123染色液中, 2 000 r/min離心5 min，用1xPBS洗兩次后在500 μl 1×PBS中重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的上機(jī)檢測(cè)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

根據(jù)Cytc、caspase3、caspase9和β-actin基因的序列, 用Primer Premier 5設(shè)計(jì)PCR引物。Cytc基因上游引物序列(F)為： 5′-CTG GGT GAC GAG TGA AAC TG-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-TGA GCA CAA CAG GAA CTG GA-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為104 bp。caspase3基因上游引物序列(F)為： 5′-GGA ACG AAC GGA CCT GTG-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-GCC TCC ACT GGT ATC TTC TG-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為135 bp。Caspase9基因上游引物序列(F)為： 5′-CCA GAT GCT GTC CCA TAC C-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-ATT GGC GAC CCT GAG AAG-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為228 bp。β-actin基因上游引物序列(F)為： 5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′, 下游引物序列(R)為： 5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為205 bp。收集終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理48 h的人胃癌MNK-45細(xì)胞, 使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA, 并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板, β-actin為內(nèi)參, 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)有3個(gè)重復(fù)后，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。得到的Ct值采用2-ΔΔCt計(jì)算獲得不同藥物濃度組別細(xì)胞中Cytc、caspase3和caspase9基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集終濃度為0、20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理48 h的人胃癌MNK-45細(xì)胞, 用蛋白裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞全蛋白后, 將蛋白煮沸變性進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳, 然后電轉(zhuǎn)移到NC膜上，使用脫脂奶粉和PBS的混合封閉液封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗后二抗孵育1 h，再用PBST洗后上機(jī)進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草對(duì)人胃癌 MKN-45細(xì)胞形態(tài)的影響

結(jié)果表明，0濃度組細(xì)胞大小均一，細(xì)胞核清晰且體積較大，呈正圓形，并有完整的細(xì)胞膜包被。與0濃度組相比，20、30、40 μg/ml白花蛇舌草處理組隨著白花蛇舌草濃度的不斷升高細(xì)胞大小不在均一并伴隨體積縮小的現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則狀態(tài)，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)高度聚集呈現(xiàn)邊緣化，視野下細(xì)胞數(shù)明顯減少，出現(xiàn)細(xì)胞碎片甚至破裂現(xiàn)象，出現(xiàn)明顯的凋亡小體(圖1)。

Fig. 1 The cell morphology of human gastric cancer MNK-45 cells treat with Hedyotis diffusa for 48 h under confocal microscopy (acridine orange, Bar=10 μm)

2.2 白花蛇舌草對(duì)人胃癌 MKN-45細(xì)胞線粒體膜電位的影響

結(jié)果表明，0濃度組細(xì)胞的線粒體膜電位為 96.4±1.96，而在終濃度為20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草處理下細(xì)胞的線粒體膜電位分別為90.9±1.67、73.0±1.16和17.4±0.81，與0濃度組相比均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01，圖2，表1)。

Fig. 2 Detection of mitochondrial membrane potential of human gastric cancer MNK-45 cells treated with hedyotis diffusa for 48 h (n= 3)

Tab. 1 Detection of mitochondrial membrane potential and Cyt c, caspase3 and caspase9 mRNA expressions in MNK-45 cells n=3)

2.3 白花蛇舌草對(duì)人胃癌 MKN-45細(xì)胞Cyt c、caspase3和caspase9基因mRNA的影響

結(jié)果表明，與0濃度組相比，隨著白花蛇舌草藥物濃度的升高，Cytc、caspase3和caspase9基因mRNA的表達(dá)均有不同程度的升高(P<0.01，表1)。

2.4 白花蛇舌草對(duì)人胃癌 MKN-45細(xì)胞Cyt c、caspase3和caspase9蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0濃度組相比，隨著白花蛇舌草藥物濃度的升高，Cyt c、caspase3和caspase9蛋白表達(dá)升高，由于caspase3和caspase9蛋白發(fā)揮作用的形式是剪接激活，因此伴隨著蛋白剪接體的從無(wú)到有線粒體途徑的凋亡現(xiàn)象也逐漸明顯，caspase3的蛋白剪接體cleaved-caspase3和caspase9的蛋白剪接體cleaved-caspase9蛋白的含量升高(P<0.05,P<0.01，圖3，表2)。

Tab. 2 The effects of Hedyotis diffusa on protein levels of Cyt c、caspase3 and caspase9 n=3)

Fig. 3 The effects of hedyotis diffusa on protein levels of Cyt c、caspase3 and caspase9 ( n= 3)

3 討論

胃癌是全球性的惡性疾病且發(fā)病率居高不下。目前為止，化療是現(xiàn)階段最有成效的治療手段之一，但現(xiàn)有的化療藥物大多都有較大的毒副作用，而白花蛇舌草作為一種天然中藥，其毒副作用明顯小于化學(xué)合成的藥物，且在抗腫瘤方面顯示良好的藥理活性[5,6]。曾珠等人也發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能夠抑制肺癌干細(xì)胞的增殖, 促進(jìn)其凋亡, 使細(xì)胞被阻滯于G1期[11]。李等人也發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移, 抑制其淋巴管形成, 使VEGF-C的表達(dá)下降[12]。本研究中顯示，白花蛇舌草可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，經(jīng)過(guò)20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草孵育48 h后，人胃癌MNK-45細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組，凋亡現(xiàn)象明顯，在終濃度為40 μg/ml時(shí)對(duì)MNK-45細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)最為明顯。

細(xì)胞凋亡則是機(jī)體自身使細(xì)胞程序性死亡的生理過(guò)程，其存在著死亡受體[13]、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[14]三條通路，其中線粒體通路在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用，是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[15,16]。李鳳巖等人發(fā)現(xiàn)甘草次酸可以促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞SW579的凋亡[17]。洪凱等人的研究發(fā)現(xiàn)2-12烷基-6-甲氧基環(huán)己基-2,5-二烯-1,4-二酮能激活OCI-LY19細(xì)胞線粒體凋亡的內(nèi)源性通路而促進(jìn)彌漫大B淋巴瘤細(xì)胞凋亡，抑制OCI-LY19細(xì)胞增殖，具有抗彌漫大B淋巴瘤的作用[18]。線粒體凋亡機(jī)制是通過(guò)改變線粒體膜的通透性，將細(xì)胞色素C等凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，此后，細(xì)胞色素C與凋亡酶激活因子1(Apaf-1)和caspase9形成凋亡體，caspase9自我剪切活化，然后在ATP等存在下將無(wú)活性的caspase3酶原剪切激活，從而引起細(xì)胞凋亡[19]。在本研究中，20、30、40 μg/ml的白花蛇舌草均可以降低MNK-45細(xì)胞線粒體膜電位，并使凋亡相關(guān)基因Cytc、caspase3和caspase9基因的表達(dá)顯著升高，且caspase3的蛋白剪接體cleaved-caspase3和caspase9的蛋白剪接體cleaved-caspase9蛋白的含量升高。其中在白花蛇舌草的終濃度達(dá)到40 μg/ml時(shí)線粒體膜電位降低至最低，Cytc、caspase3和caspase9基因的表達(dá)升至最高。提示白花蛇舌草刺激人胃癌MNK-45細(xì)胞后可能通過(guò)引起線粒體膜通透性改變，降低線粒體膜電位，釋放Cyt c，促發(fā)caspase細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，caspase-3凋亡途徑被激活并參與白花蛇舌草誘導(dǎo)的人胃癌MNK-45細(xì)胞凋亡機(jī)制。由于藥物對(duì)人胃癌MNK-45細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)需要一定周期，基因表達(dá)的改變一般發(fā)生在給藥的24 h后，但是出現(xiàn)蛋白質(zhì)改變一般要晚于基因表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)在48 h對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。這與蔣顯發(fā)現(xiàn)的藥物可誘使線粒體釋放凋亡因子使線粒體膜電位降低促使細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致[20]。

綜上所述，白花蛇舌草能夠使人胃癌MNK-45細(xì)胞線粒體膜電位降低，上調(diào)Cytc、caspase3和caspase9基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗胃癌的作用。白花蛇舌草較為常見(jiàn)，價(jià)格低廉，本研究結(jié)果可為其在腫瘤臨床治療中研發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。