崔永禎,趙 紅*,黃 格,鄭愛清,李社萍**,李 鳴

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所,云南 昆明 650205；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究所,廣西 南寧 530005)

低溫冷害作為糧食生產(chǎn)中最嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一,給糧食生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也是水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一個(gè)主要制約因素[1,2]。開展水稻耐冷性育種是解決水稻冷害問題的關(guān)鍵,而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源耐冷基因?qū)胨疽云谂嘤休^強(qiáng)耐冷性的水稻品種是值得探索的課題。隨著對(duì)耐冷相關(guān)基因及其功能的深入研究,學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為植物冷調(diào)節(jié)基因(COR)是目前研究調(diào)控機(jī)理最為清楚的基因之一[3]。Artus等通過研究擬南芥的耐冷基因Atcor15a發(fā)現(xiàn),該基因在一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐冷性[4]。司婧等將高山冷芥耐冷基因Cbcor15a轉(zhuǎn)入煙草的愈傷組織,明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐冷性和耐凍性[5]。滕征等通過將外源耐冷基因Cbcor15a轉(zhuǎn)入甘蔗愈傷組織中,獲得了轉(zhuǎn)基因甘蔗陽(yáng)性植株[6]。將外源耐冷基因Cbcor15a導(dǎo)入水稻品種,以提高水稻耐冷性的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將高山離子芥的冷誘導(dǎo)基因Cbcor15a導(dǎo)入水稻品種日本晴,以期獲得具有耐冷性的水稻品種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冷誘導(dǎo)基因Cbcor15a由蘭州大學(xué)生命科學(xué)院安黎哲教授提供。水稻品種日本晴、質(zhì)粒pCAMBIA3300、質(zhì)粒pMD-COR、大腸桿菌菌株DH5α,以及根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。乙酰丁香酮(AS)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、氨芐青霉素(Amp)、植物凝膠等均購(gòu)自Sigma公司;頭孢霉素(Cef)購(gòu)自上海生工公司;Gel Red熒光染料購(gòu)自Biotiμmol/L公司;PCR耗材、試劑、Marker、Taq酶、質(zhì)粒提取與純化試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司;PCR引物合成及基因測(cè)序均由上海生工公司完成;其他常用試劑主要購(gòu)自上海生工公司。

1.2 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基及其配方如表1所示。

表1 水稻品種日本晴遺傳轉(zhuǎn)化體系所用的培養(yǎng)基配方

1.3 愈傷組織的制備及預(yù)培養(yǎng)

選取水稻品種日本晴健康飽滿的成熟種子作為研究對(duì)象。剝?nèi)シN子的外穎和內(nèi)穎,用75%乙醇消毒法對(duì)種子表面進(jìn)行消毒[7]。將消毒后的種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,在(28±2)℃下24 h全光照培養(yǎng)2周,使之長(zhǎng)出胚性愈傷組織。選擇生長(zhǎng)較好、淡黃色、致密、相對(duì)干燥的胚性愈傷組織,用刀片將胚性愈傷組織與胚乳、芽、根和盾片分離后,轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基,進(jìn)行繼代培養(yǎng)1周。選擇相對(duì)干燥、致密的胚性愈傷組織,將愈傷組織切成直徑約0.5 cm的小塊,接入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基,在26 ℃下暗培養(yǎng)3 d。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)菌液的制備

用劃線接種法將含有目的基因Cbcor15a的pCAMBIA-COR載體[8]的農(nóng)桿菌菌株接種到Y(jié)EP固體篩選培養(yǎng)基(含有Rif和Kan)上,在28 ℃下培養(yǎng)2 d;然后將活化的菌株轉(zhuǎn)移至AAM懸浮培養(yǎng)基中,置于28 ℃恒溫?fù)u床,以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)3.5 h;最后使用分光光度計(jì)將菌液濃度OD600值調(diào)至0.8和1.0之間,以備侵染。

1.5 農(nóng)桿菌侵染愈傷組織

在超凈工作臺(tái)上,挑選生長(zhǎng)活力較好的水稻愈傷組織作為農(nóng)桿菌的侵染對(duì)象。用鑷子輕輕取出待侵染的愈傷組織,在干燥的無菌濾紙上放置1 h左右,至愈傷組織表面干燥,且略有收縮;然后將愈傷組織浸泡在含有誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(Acetosyringone, AS)100 μmol/L和農(nóng)桿菌(OD600=0.8～1.0)的AAM轉(zhuǎn)化液中,于搖床上緩慢搖動(dòng)20 min;然后將愈傷組織取出并置于干燥的無菌濾紙上,在無菌條件下吹至愈傷組織表面無水漬,略微干燥；最后將愈傷組織接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基,在25 ℃下暗培養(yǎng)3 d。

1.6 除草劑敏感性實(shí)驗(yàn)

除草劑Phosphinothricin (PPT)會(huì)明顯抑制水稻愈傷組織的生長(zhǎng),高濃度的PPT使水稻愈傷組織出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象,甚至死亡。轉(zhuǎn)化植株因含有Bar基因(抗除草劑基因)而對(duì)除草劑具有很好的抗性,故PPT是水稻遺傳轉(zhuǎn)化中比較理想的一種篩選劑。選擇生長(zhǎng)良好、繼代培養(yǎng)兩次的水稻愈傷組織進(jìn)行PPT敏感性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置PPT濃度分別為0、2、5、10、15、20、25、30 mg/L的L3繼代培養(yǎng)基,在26 ℃下暗培養(yǎng)2周,根據(jù)愈傷組織的生長(zhǎng)和褐化情況,確定適合水稻愈傷組織的最佳PPT篩選濃度。

1.7 抗生素濃度的篩選

頭孢霉素Cefotaxime Sodium (Cef)可以抑制農(nóng)桿菌的增殖,使用低濃度的Cef會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌大量增殖進(jìn)而影響愈傷組織生長(zhǎng)；而高濃度的Cef則會(huì)明顯抑制愈傷組織的生長(zhǎng),故需要篩選出適宜濃度的Cef,使之既能有效抑菌,又不明顯影響水稻愈傷組織的正常生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)Cef濃度為300、400和500 mg/L；將侵染后的水稻愈傷組織分別轉(zhuǎn)移至含有不同濃度Cef 的3種篩選培養(yǎng)基上,在26 ℃下暗培養(yǎng)7 d。根據(jù)農(nóng)桿菌的增殖情況,確定合適水稻愈傷組織的最佳Cef篩選濃度。

1.8 水稻抗性愈傷組織的篩選

將侵染及共培養(yǎng)后的水稻愈傷組織用無菌水清洗5～6次至水澄清透明,然后轉(zhuǎn)移至含有500 mg/L Cef的無菌水中,浸泡15 min,期間輕緩搖動(dòng)2～3次;將愈傷組織轉(zhuǎn)移至無菌、干燥的濾紙上,吹至愈傷組織表面無水漬,略干燥;將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有最佳濃度的Cef和PPT的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,在26 ℃下暗培養(yǎng),每隔2周更換1次培養(yǎng)基,期間及時(shí)剔除被污染的水稻愈傷組織；共培養(yǎng)約4周。

1.9 水稻抗性愈傷組織的分化

經(jīng)過Cef和PPT篩選后,將生長(zhǎng)較好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有最佳濃度的Cef和PPT的分化培養(yǎng)基上,在28 ℃下以光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng),每隔2周更換1次培養(yǎng)基,待分化出苗后,將高度約3 cm的水稻再生分化苗轉(zhuǎn)移至壯苗生根培養(yǎng)基,在26 ℃下全光照培養(yǎng)。挑選根系發(fā)達(dá)、高度約6 cm的水稻再生分化苗進(jìn)行煉苗，最后將其移栽至水、肥均衡的泥盆中。

1.10 檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株

1.10.1 常規(guī)PCR檢測(cè) 取再生分化苗的幼嫩組織,采用CTAB法提取水稻葉片的總DNA,利用PCR技術(shù)檢測(cè)再生苗。根據(jù)目的基因CbCor15a和篩選標(biāo)記Bar基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物: P1,5′ATGGCGATGTCATTTTCA3′;P2,5′CTTGGTGGCATCCTTAGCA3′。分別以水稻轉(zhuǎn)化植株的DNA為模板,以pCambia1300-cbcor15a重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照模板,未轉(zhuǎn)化水稻的DNA為陰性對(duì)照模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。取各PCR產(chǎn)物5 μL,用1%TBE瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.10.2 用除草劑驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株 分別選用Basta濃度為0.050%、0.090%、0.100%、0.125%的除草劑溶液，將其涂抹在未經(jīng)轉(zhuǎn)化的空白水稻葉片上,篩選出空白水稻植株葉片正好變黃枯死的除草劑濃度,作為驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株的最適Basta使用濃度,對(duì)轉(zhuǎn)化水稻植株的葉片進(jìn)行涂抹檢測(cè),在涂抹除草劑約3 d后,葉片變黃枯死的植株為陰性苗,仍為綠色正常生長(zhǎng)的植株則為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌重組菌株EHA105-COR的鑒定

通過PCR檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌EHA105是否含有植物表達(dá)載體pCAMBIA-COR。隨機(jī)挑取8個(gè)農(nóng)桿菌重組單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),以DL 2000 marker(M)為參照,結(jié)果如圖1所示,經(jīng)擴(kuò)增均得到目的條帶(423 bp)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, pCAMBIA-COR已被成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中,8個(gè)轉(zhuǎn)化子皆為陽(yáng)性重組菌株。將陽(yáng)性農(nóng)桿菌重組菌株命名為EHA105-COR。

M: DL 2000 marker；1～8:8個(gè)EHA105-COR單菌落活化菌液。

2.2 PPT敏感性實(shí)驗(yàn)

使用PPT篩選水稻愈傷組織能夠大大降低假陽(yáng)性植株的篩選數(shù)量,減少后續(xù)陽(yáng)性植株鑒定的工作量,縮短轉(zhuǎn)化周期。選擇生長(zhǎng)良好、繼代培養(yǎng)兩次的水稻愈傷組織進(jìn)行PPT的敏感性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置PPT濃度為0、2、5、10、15、20、25、30 mg/L的L3繼代培養(yǎng)基,在26 ℃下暗培養(yǎng)2周,根據(jù)愈傷組織的生長(zhǎng)和褐化情況,確定合適日本晴愈傷組織的最佳PPT篩選濃度。由于PPT對(duì)不同水稻品種成熟胚的愈傷組織誘發(fā)了不同程度的褐化,無法準(zhǔn)確計(jì)算其褐化率，因此,本實(shí)驗(yàn)用文字描述在不同PPT濃度處理下水稻品種愈傷組織的總體褐化情況。

從表2和圖2中可以看出：在10 mg/L PPT處理下少部分的日本晴愈傷組織開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；在20 mg/L PPT處理下大部分的愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,但仍有小部分的愈傷組織保持黃色；當(dāng)PPT濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，日本晴的愈傷組織開始全部褐化。因此,本實(shí)驗(yàn)選用25 mg/L的PPT濃度作為水稻品種日本晴遺傳轉(zhuǎn)化的最佳篩選濃度。

表2 不同濃度PPT對(duì)水稻品種日本晴愈傷組織的影響

圖2 不同濃度PPT對(duì)日本晴愈傷組織的影響

2.3 抗生素濃度的篩選結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)將侵染后的水稻愈傷組織分別轉(zhuǎn)移至含有300、400和500 mg/L Cef的3種篩選培養(yǎng)基上,在26 ℃下暗培養(yǎng)7 d后,記錄農(nóng)桿菌的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如表3)表明：當(dāng)Cef濃度為300～400 mg/L時(shí),超過57.5%的愈傷組織被迅速增殖的農(nóng)桿菌影響;當(dāng)Cef濃度為500 mg/L時(shí),其可以明顯抑制農(nóng)桿菌的繁殖,污染率只有9.6%,大多數(shù)的愈傷組織可以正常生長(zhǎng)(如圖3)。故選擇Cef濃度500 mg/L作為轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌的抑制濃度。

表3 不同濃度Cef對(duì)日本晴愈傷組織的影響

圖3 不同濃度的Cef對(duì)日本晴愈傷組織生長(zhǎng)的影響

2.4 含Cbcor15a的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得了水稻品種日本晴的轉(zhuǎn)化植株(如圖4所示)。本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌侵染處理日本晴愈傷組織220塊,共得到抗性愈傷組織136塊,抗性愈傷組織得率為61.8%,最終獲得日本晴轉(zhuǎn)化苗9株。

2.5 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

2.5.1 PCR檢測(cè) 以獲得的9株日本晴轉(zhuǎn)化苗(編號(hào)為T01～T09)葉片的總DNA為模板,以P1/P2為引物,以pCAMBIA-COR質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照模板,以未轉(zhuǎn)化的日本晴葉片DNA作為陰性對(duì)照模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。然后分別取PCR產(chǎn)物5 μL,采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖5)顯示,有8株日本晴轉(zhuǎn)化苗擴(kuò)增得到與目的基因片段大小一致的條帶,初步鑒定獲得8株P(guān)CR陽(yáng)性植株。

M: DL 2000 marker； CK+: pCAMBIA-COR質(zhì)粒； CK-:未經(jīng)轉(zhuǎn)化的日本晴。

2.5.2 抗除草劑檢測(cè) 在本實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)基因植株由于含有Bar基因篩選標(biāo)記,而Bar對(duì)除草劑具有抗性,由此,可通過選擇合適濃度的除草劑溶液涂抹水稻葉片,觀察葉片是否變黃,初步驗(yàn)證和篩選轉(zhuǎn)化植株的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗。分別用0.050%、0.090%、0.100%和0.125%的除草劑Basta溶液涂抹同株未轉(zhuǎn)化的日本晴葉片,分別編號(hào)為1、2、3和4(如圖6所示),篩選出未轉(zhuǎn)化水稻葉片明顯枯黃的Basta濃度,作為檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的最佳使用濃度。

圖6 Basta濃度的篩選結(jié)果

結(jié)果顯示,4個(gè)Basta溶液濃度對(duì)未轉(zhuǎn)化的日本晴葉片1、2、3和4均造成了不同程度的變黃,其中0.125% Basta溶液對(duì)水稻葉片的枯黃致死效果最為明顯。因此,選用0.125% Basta溶液涂抹轉(zhuǎn)基因植株的葉片，以檢測(cè)其抗性。

從圖7可以看出：使用0.125% Basta溶液涂抹后,有6株日本晴轉(zhuǎn)化植株的葉片無變黃現(xiàn)象,表現(xiàn)出對(duì)該除草劑的抗性；有2株轉(zhuǎn)化植株的葉片明顯變黃,無除草劑抗性。這與經(jīng)過PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的8株轉(zhuǎn)化苗結(jié)果不一致。無除草劑抗性的2株可能是假陽(yáng)性植株,也可能是轉(zhuǎn)入拷貝數(shù)較低,所以未表現(xiàn)出明顯的除草劑抗性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,有除草劑抗性的6株日本晴轉(zhuǎn)化苗是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因日本晴植株。

圖7 轉(zhuǎn)基因日本晴植株表現(xiàn)出對(duì)Basta的抗性

3 討論與結(jié)論

水稻傳統(tǒng)的育種方法是雜交育種,但很難快速獲得品質(zhì)較好的耐冷性水稻品種。基因工程技術(shù)的發(fā)展為水稻優(yōu)良品種的快速繁育提供了新的途徑,將目的基因?qū)氩⒄系剿镜幕蚪M中,從而在水稻中得到遺傳和表達(dá),可以快速、準(zhǔn)確地獲得性狀優(yōu)良的水稻新品種。利用基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電擊法研究植物基因轉(zhuǎn)化已經(jīng)有成功的報(bào)道[9,10]。在已獲得的轉(zhuǎn)基因植物中,80%以上是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的[11-12]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化成本低廉、技術(shù)簡(jiǎn)單、容易操作;另外,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因外源基因插入拷貝數(shù)低,對(duì)受體傷害小,而且可實(shí)現(xiàn)大片段DNA的轉(zhuǎn)化。迄今為止,已在7個(gè)科20多種單子葉植物上利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化基因獲得成功。禾谷類糧食作物水稻、玉米、小麥、大麥等也能被農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)化[6]。本文以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)Cbcor15a基因轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴的研究,是利用生物工程改良水稻品種,加快水稻育種進(jìn)程,縮短育種周期的具體表現(xiàn)。本研究為深入評(píng)價(jià)利用轉(zhuǎn)Cbcor15a基因選育具有耐冷性水稻新品種的可行性提供了轉(zhuǎn)基因材料。

本文以高山離子芥冷誘導(dǎo)基因Cbcor15a為目的基因,以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因Cbcor15a導(dǎo)入水稻愈傷組織，初步建立了適于水稻品種日本晴的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,水稻成熟胚在(28±2)℃、全光照培養(yǎng)條件下,約2周即可獲得適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的愈傷組織。對(duì)于水稻品種日本晴,篩選時(shí)使用Cef 500 mg/L和PPT 25 mg/L,分化時(shí)由于Bar基因尚未完全表達(dá),PPT在一定程度上會(huì)影響愈傷組織的分化,因此使用15 mg/L PPT較為適合。通過Cef和PPT篩選,本實(shí)驗(yàn)共獲得了日本晴轉(zhuǎn)化Cbcor15a基因再生苗9株；經(jīng)PCR檢測(cè)和Basta涂抹實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn),有6株日本晴轉(zhuǎn)化苗為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。