張婉琪,王哲紅,張瑩鈺,王青青,崔 鑫,朱廣藝,胡建軍

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾843300 ； 2.哈密市動(dòng)物疾病預(yù)防與控制中心 ，新疆哈密839000 ； 3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾843300 ； 4.哈密市信訪局 ，新疆哈密839000)

僅對(duì)牛乳頭瘤病毒部分基因序列進(jìn)行分析，難以掌握病毒的遺傳特性。因此，本研究從分子水平上對(duì)新疆南疆牛乳頭瘤病毒1型SY-12株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定和基因組結(jié)構(gòu)特征分析，為進(jìn)一步開展新疆南疆乳頭狀瘤基因功能研究和疾病疫源追溯提供科學(xué)依據(jù)。

圖4 SY-12基因組結(jié)構(gòu)圖
Fig.4 Structure of complete genomic sequence of the SY-12 strain
A：SY-12株基因組結(jié)構(gòu)示意圖；序列代表上游調(diào)控區(qū)的各結(jié)構(gòu)，紅色加粗代表E1結(jié)合位點(diǎn)(AACAAT)EIBS；綠色加粗下劃線代表TATA框(TATAAAA/T)；黃色背景代表回文結(jié)構(gòu)(TCGGTGCACCGA)；藍(lán)色加粗下劃線代表核因子結(jié)合位點(diǎn)NF-1(TTGGCA)；方框內(nèi)代表多腺苷酸化信號(hào)PolyA(AATAAA)；加粗下劃線代表E2結(jié)合位點(diǎn)(E2BS)的共有序列(ACC-N6-GGT)；雙下劃線代表6T串聯(lián)區(qū)(TTTTTT)；灰色背景波浪線代表6A串聯(lián)區(qū)(AAAAAA)
A: Genomic structure of SY-12. The sequences represent the structures of the upstream regulatory region. Bold and red texts denote the E1 binding site (AACAAT). Bold and green texts denote the TATA box (TATAAAA/T). Shaded boxes of yellow denote the palindrome structure (TCGGTGCACCGA). Bold and blue texts denote the NF-1 (TTGGCA). The rectangle denotes polyadenylation signals (AATAAA). Bold and underline denotes the E2 binging motif (ACC-N6-GGT). A double underline denotes the series of TTTT. Wavy lines and shaded boxes denote the series of AAAAAA

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)樣品的采集來源于新疆南疆某養(yǎng)殖戶患病牛，-20 ℃保存?zhèn)溆玫?0%甘油磷酸緩沖液中保存樣品。

1.2 引物設(shè)計(jì) 通用引物MY11和MY09作為BPV基因分型擴(kuò)增引物[3]，以NC001522和X02346為參考序列設(shè)計(jì)全基因擴(kuò)增引物，引物序列如表1所示，所有引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增引物Table 1 Specific primers

1.3 PCR反應(yīng)體系 采用20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL，ddH2O 15.5 μL，2×LA Buffer 2.0 μL，引物Primer F(10 mmol/L)0.4 μL，引物Primer R(10 mmol/L)0.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；54 ℃退火45 s；72 ℃每kb延伸1 min；32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增片段大小。

1.4 PCR產(chǎn)物純化回收測(cè)序 取PCR切膠回收產(chǎn)物，參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物，并送北京金諾銳杰基因科技有限公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)的拼接及序列分析 測(cè)序序列在NCBI中進(jìn)行BLAST， MEGA6.0軟件鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 SY-12株全基因組PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中BPV-1參考毒株序列(NC001522和X02346)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，對(duì)新疆南疆SY-12流行株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到1個(gè)大的擴(kuò)增片段，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離得到約為7 800 bp的大片段，結(jié)果見圖1。

圖1 PCR 擴(kuò)增SY-12株全基因組的電泳結(jié)果
Fig.1 PCR amplification for the completegenome of the SY-12 strainM：DL-10 000 Marker； 1：陰性對(duì)照； 2：目的片段
M: DL-10 000 Marker; 1: Negative control; 2: Target fragment

2.2 SY-12株全基因組測(cè)序同源性分析 使用DNASTAR.Lasergene.v7.1對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，得到SY-12株全基因組序列(登錄號(hào)為KX907623.1)，全長為7 946 bp，A+T含量為54.76%，G+C含量為45.24%。使用DNASTAR MegAlign的Clustal W Method對(duì)SY-12株全基因組與BPV參考毒株序列全基因組比較分析，SY-12株與BPV-1型參考株(X02346和NC001522)的核苷酸同源性達(dá)到99.4%和99.4%，與BPV-2型參考株(PPB2CG和KC878306)的核苷酸同源性均達(dá)到了87.1%，與BPV-13型參考株(JQ798171)的核苷酸同源性達(dá)到了85.7%，見圖2。

其中，Wij為空間權(quán)重，表示地區(qū)i與地區(qū)j二者的位置關(guān)系；n為觀察值的數(shù)目；yi和yj分別代表樣本i和j所處地點(diǎn)的觀察值為樣本點(diǎn)的平均值。

2.3 BPV不同基因型系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 依據(jù)BPV基因組中最保守的，并被廣泛用于基因分型的，負(fù)責(zé)編碼主要外殼蛋白的L1基因?yàn)榛鶞?zhǔn)[4-5]。以不同基因型BPV的L1基因?yàn)閰⒄招蛄?，?yīng)用MegAlign軟件對(duì)SY-12株與BPV不同基因型的L1基因序列進(jìn)行同源性分析，采用MEGA 6軟件建立相應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖3。

圖2 BPV全基因組序列同源性分析
Fig.2 Homology analysis of the complete genomic sequence of BPV

圖3L1基因序列構(gòu)建的不同基因型BPV系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.3 Phylogenetic tree inferred from theL1 nucleotidesequences of different genotypes of BPV▲： 代表SY-12株 ▲:Refers to SY-12 strain

從進(jìn)化樹上可以看出：SY-12株與BPV-1參考株(X01346和NC-001522.1)位于同一進(jìn)化分支上，均為BPV-1基因型。同時(shí)，與參考株BPV-2型(PPB2CG和KC878306)、BPV-13型(JQ798171)同屬Delta屬。BPV-5(AF457465)和BPV-8(DQ098913)屬于Epsilon屬；BPV-3(AF486184)，BPV-4(X05817)，BPV-6(AJ620208)，BPV-9(AB331650)，BPV-10(AB331651)，BPV-11(AB543507)和BPV-12(JF834523)同屬Xi屬，以及還未被定義的PV屬BPV-7(NC-007612)。

2.4 SY-12株與參考株全基因組核苷酸序列差異比較 通過對(duì)SY-12株全基因組與BPV-1型參考株(X01346和NC-001522.1)比較分析，在4 094～4 375 nt和7 643～7 916 nt之間核苷酸序列有較大差異，見表2、表3。

2.5 SY-12株與參考株核苷酸和氨基酸同源性分析 將SY-12株與同屬各參考株，BPV-1型參考株(X01346和NC-001522.1)、BPV-2型參考株(PPB2CG和KC878306.1)和BPV-13型參考株(JQ798171)功能基因片段E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1和L2的核苷酸、氨基酸分別進(jìn)行核苷酸與氨基酸同源性比較。結(jié)果見表4、表5。

表2 4 094～4 375 nt核苷酸差異Table 2 Nucleotide difference of 4 094～4 375 nt

表3 7 643～7 916 nt核苷酸差異Table 3 Nucleotide difference of 7 643～7 916 nt

表4 SY-12株與參考株核苷酸同源性比較分析Table 4 Comparison and analysis of nucleotide homology between SY-12 strain and reference strains (%)

表5 SY-12株與參考株氨基酸同源性比較分析Table 5 Comparison and analysis of amino acid homology between SY-12 strain and reference strains (%)

2.6 SY-12株全基因組結(jié)構(gòu)分析 SY-12株全基因組序列與GenBank中BPV-1型參考株全基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，SY-12株含有BPV-1基因型所具有的結(jié)構(gòu)特征，包括3個(gè)區(qū)域，非編碼區(qū)(Non-coding region)，即病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄必要元件的上游調(diào)控區(qū)(URR)或長控區(qū)(Long control region，LCR區(qū))，早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))，含6個(gè)開放讀碼框(ORFs)；負(fù)責(zé)編碼衣殼蛋白的晚期基因區(qū)(L區(qū))，含L1和L2兩個(gè)ORFs[6-8]。

通過與BPV-1型參考序列比對(duì)，提交BPV-1型SY-12株全基因組序列至GenBank，獲得登錄號(hào)為KX907623.1。各功能基因位置如下：91～504 nt為E6基因，479～862 nt為E7基因，849～2 666 nt為E1基因，2 608～3 840 nt為E2基因，3 191～3 529 nt為E4基因，3 879～4 013 nt為E5基因，4 187～5 596 nt為L2基因，5 609～7 096 nt為L1基因；其余則為非編碼區(qū)即病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄的上游調(diào)控區(qū)和長控區(qū)，并且基因組缺失E3和E8基因。

在早期轉(zhuǎn)錄區(qū)，SY-12株基因組的E區(qū)含有6個(gè)開放閱讀框，分別為E6、E7、E1、E2、E4和E5，其中E6、E7和E1基因有部份重疊，E4完全在E2中，在3 191～3 529 nt。結(jié)構(gòu)圖見中插彩版圖4，具體分析如下。

分析SY-12株全基因組序列，具有E1結(jié)合位點(diǎn)(AACAAT)EIBS，即非編碼區(qū)4～9 nt和長控區(qū)6 557～6 562 nt；在SY-12株全基因組序列具有TATA框(TATAAAA/T)，即非編碼區(qū)58～64 nt和7 109～7 115 nt；在SY-12株全基因組序列具有回文結(jié)構(gòu)即BPV非編碼區(qū)增強(qiáng)子的序列TCGGTGCACCGA，7 627～7 638 nt；在SY-12株全基因組序列中具有4個(gè)核因子結(jié)合位點(diǎn)NF-1(TTGGCA)，即位于E6基因282～287 nt、E4基因3 469～3 474 nt、L2基因4 732～4 737 nt和非編碼區(qū)7 326～7 331 nt處；在SY-12株全基因組序列中存在4個(gè)多腺苷酸化信號(hào)PolyA(AATAAA)，即晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)4 180～4 185 nt和6 434～6 439 nt處，非編碼區(qū)7 092～7 097 nt和7 156～7 161 nt處。

在SY-12株全基因組序列中存在10個(gè)E2結(jié)合位點(diǎn)(E2BS)的共有序列ACC-N6-GGT[9]，即位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因E1的2 396～2 407 nt處，非編碼區(qū)的7 203～7 214 nt、7 365～7 376 nt、7 408～7 419 nt、7 510～7 521 nt、7 591～7 602 nt、7 620～7 631 nt、7 760～7 771 nt、7 781～7 792 nt、7 896～7 907 nt。

在SY-12株全基因組序列中存在19個(gè)6T串聯(lián)區(qū)(TTTTTT)，即非編碼區(qū)26～31 nt處，位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因E1的1 455～1 460 nt、1 889～1 894 nt、2 048～2 053 nt、2 049～2 054 nt、2 192～2 197 nt、2 546～2 551 nt、2 547～2 552 nt，位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因E5的3 957～3 962 nt，位于晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因L2的4 123～4 128 nt，跨L2基因與非編碼區(qū)的5 597～5 602 nt，位于非編碼區(qū)的5 598～5 603 nt和5 599～5 604 nt，位于晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因L1的5 703～5 708 nt和6 338～6 343 nt，位于非編碼區(qū)的7 438～7 443 nt、7 439～7 444 nt、7 440～7 445 nt、7 924～7 929 nt。

在SY-12株全基因組序列中存在23個(gè)六A串聯(lián)區(qū)(AAAAAA)，位于非編碼區(qū)的40～45 nt，位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因E6的384～389 nt，位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因E1的1 510～1 515 nt、2 120～2 125 nt、2 121～2 126 nt、2 122～2 127 nt、2 123～2 128 nt，位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因E2的2 749～2 754 nt，位于晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因L2的5 575～5 580 nt、5 576～5 581 nt，位于晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因L1的6 166～6 171 nt、7 056～7 061 nt、7 078～7 083 nt、7 079～7 084 nt、7 080～7 085 nt、7 081～7 086 nt、7 082～7 087 nt、7 083～7 088 nt、7 084～7 089 nt、7 085～7 090 nt、7 086～7 091 nt、7 087～7 092 nt、7 088～7 093 nt。

SY-12株氨基酸序列中，E6和E7蛋白的氨基酸序列中出現(xiàn)典型的鋅指結(jié)構(gòu)(CX2CX29CX2C)[10]，E2蛋白缺乏亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(LX6LX6LX6LX6L)[11]。

3 討論

乳頭瘤病毒(Papilloma Virus，PV)是一類閉合環(huán)狀的[12]DNA致瘤病毒，BPV是PV家族成員之一[13]。根據(jù)對(duì)BPV核苷酸同源性分析，已確定BPV有13個(gè)基因型以及若干未分類的假定基因型，而這些牛乳頭狀瘤病毒主要包含在4個(gè)不同的屬內(nèi)：Delta屬、Epsilon屬、Xi屬以及還未被定義的PV屬(BPV-7)。本試驗(yàn)依據(jù)1對(duì)通用引物對(duì)新疆南疆某農(nóng)戶的患牛病料進(jìn)行了病毒的PCR法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為牛乳頭狀瘤病毒基因1型。采用特異性擴(kuò)增引物和測(cè)序引物對(duì)SY-12株全基因組序列進(jìn)行測(cè)序，成功克隆BPV-1-SY-12的全長序列，SY-12株全基因組與BPV參考毒株序列全基因組核苷酸序列比較分析顯示，BPV-1型SY-12株與參考株BPV-1型(X01346和NC-001522.1)、BPV-2型參考株(PPB2CG和KC878306.1)和BPV-13型(JQ796171)的核苷酸同源性達(dá)到了99.4%、99.4%、87.1%、87.1%和85.7%，并同屬Delta屬。結(jié)果顯示，SY-12株全基因組與BPV-1參考毒序列核苷酸序列存在著部分差異，但是新疆南疆SY-12株可能與BPV1-X01346和BPV1-NC-001522.1流行株具有相同的來源。

對(duì)BPV-1-SY-12全基因組序列分析，全基因組長為7 946 bp，GC%含量為45.24%，共有8個(gè)開放閱讀框，即6個(gè)早期編碼區(qū)和2個(gè)晚期編碼區(qū)依次為E6、E7、E1、E2、E4、E5、和L1、L2。其中E6與E7基因部分片段重疊，E7和E1基因部分重疊，E1和E2基因部分重疊，E4基因完全包含在E2基因內(nèi)。

對(duì)SY-12全基因組分析，在早期轉(zhuǎn)錄區(qū)存在2個(gè)核因子結(jié)合位點(diǎn)NF-1(TTGGCA)，在晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)和上游調(diào)控區(qū)各有1個(gè)核因子結(jié)合位點(diǎn)NF-1(TTGGCA)，在非編碼區(qū)和長控區(qū)各有1個(gè)E1結(jié)合位點(diǎn)(AACAAT)EIBS，在非編碼區(qū)和上游調(diào)控區(qū)各具有1個(gè)TATA框(TATAAAA/T)，在上游調(diào)控區(qū)具有BPV非編碼區(qū)增強(qiáng)子的序列TCGGTGCACCGA即回文結(jié)構(gòu)，在晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)中存在2個(gè)多腺苷酸化信號(hào)PolyA(AATAAA)，在上游調(diào)控區(qū)存在2個(gè)多腺苷酸化信號(hào)PolyA(AATAAA)。

在SY-12株全基因組序列中存在10個(gè)E2結(jié)合位點(diǎn)(E2BS)的共有序列ACC-N6-GGT，主要位于早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和上游調(diào)控區(qū)[14-15]。在SY-12株全基因組序列中存在多個(gè)6T串聯(lián)區(qū)(TTTTTT)和6A串聯(lián)區(qū)(AAAAAA)，并且在SY-12株氨基酸序列中，在E6和E7蛋白的氨基酸序列中均出現(xiàn)典型的鋅指結(jié)構(gòu)(CX2CX29CX2C)[10]。目前認(rèn)為該結(jié)構(gòu)是細(xì)胞內(nèi)核酸結(jié)合蛋白所具備的特異性結(jié)構(gòu)，因而認(rèn)為E6、E7蛋白是DNA結(jié)合蛋白，可以調(diào)節(jié)基因的活性，進(jìn)一步影響宿主細(xì)胞的增殖和分化，使該過程失去控制而形成腫瘤[10,15]。

目前對(duì)牛乳頭瘤病毒的研究多集中針對(duì)功能基因和基因型鑒定的方向，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從分子水平上闡明乳頭狀瘤病毒不同基因型和基因結(jié)構(gòu)成為可能。新疆南疆SY-12流行株全基因組序列的測(cè)定，對(duì)我國以及新疆地區(qū)的牛乳頭狀瘤的病原鑒定、流行規(guī)律和遺傳演化起到重要的作用。