丁 燕， 夏雨佳， 胡 明

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科，武漢 430014

最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)在我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均高居第5位，嚴(yán)重威脅國(guó)民的生命健康[1]。近年來(lái)，隨著結(jié)腸鏡的普及和包括手術(shù)、放化療及分子靶向治療等在內(nèi)的多種治療手段的不斷進(jìn)步，一定程度改善了CRC患者的臨床預(yù)后，但其總體生存率仍不盡如人意[2]。CRC的發(fā)生進(jìn)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜多步驟過(guò)程，其潛在分子機(jī)制仍不清楚[3]。因此，探究CRC惡性進(jìn)展機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo)，對(duì)于改善CRC的預(yù)后具有重要意義。三結(jié)構(gòu)域蛋白14(tripartite motif 14，TRIM14)作為三結(jié)構(gòu)域蛋白家族的一員，表達(dá)于多種細(xì)胞，廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生物學(xué)過(guò)程[4]。最近的研究表明，TRIM14在肝細(xì)胞癌[5]、骨肉瘤[6]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[7]、乳腺癌[8]、膠質(zhì)瘤[9]及胃癌[10]等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及藥物耐受等密切相關(guān)。然而，TRIM14在CRC中的表達(dá)及其與患者臨床病理學(xué)特征及遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系，尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)了TRIM14在129例CRC組織中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，探究TRIM14表達(dá)在CRC遠(yuǎn)期預(yù)后中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇于2014年1月～2015年12月在武漢市中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的CRC患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)明確診斷為CRC；術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療；接受規(guī)范性的根治手術(shù)治療；患者臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前已轉(zhuǎn)移、接受姑息性切除的患者；5年內(nèi)有其他惡性腫瘤既往史者。按照上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終共有129例CRC患者納入本回顧性分析。納入患者的平均年齡為(63.65±9.01)歲，患者的術(shù)后病理分期采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(Union for International Cancer Control，UICC)第7版腫瘤分期系統(tǒng)。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化染色

組織標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、制作成4μm厚組織切片，60 ℃烤片2 h，二甲苯溶液浸泡2×15 min進(jìn)行脫蠟。依次以不同濃度乙醇(100%、95%、90%、75%、70%)水化各5 min，再采用檸檬酸鈉(10 mmol/L，pH 6.0)微波20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，置于室溫冷卻30 min。再用甲醇配制的3%過(guò)氧化氫處理20 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。5%牛血清蛋白封閉2 h后，孵育兔抗TRIM14一抗(1∶500，美國(guó)Abcam公司)，4 ℃過(guò)夜，次日滴加標(biāo)記有HRP的二抗(山羊抗兔二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司)，室溫孵育30 min，DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木精行細(xì)胞核復(fù)染，乙醇水化及二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行閱片和結(jié)果判定。

1.3 免疫組化結(jié)果評(píng)分

免疫組化染色結(jié)果判定根據(jù)每個(gè)高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，具體如下：在200倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)200個(gè)CRC細(xì)胞及正常細(xì)胞，分別根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行讀片。染色強(qiáng)度：0分(陰性)，1分(弱陽(yáng)性，淡黃色)，2分(中等強(qiáng)度，黃色)和3分(強(qiáng)陽(yáng)性，棕黃色或褐色)；陽(yáng)性細(xì)胞百分率：0分(≤5%)，1分(～25%)，2分(～50%)，3分(～75%)，4分(>75%)。以兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終的評(píng)分，10個(gè)視野評(píng)分結(jié)果取平均值，0分定為陰性(-)，總分≤6分定義為低表達(dá)，>6分定義為高表達(dá)。

1.4 臨床資料收集整理

通過(guò)查閱患者病歷檔案，收集患者臨床病理信息，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)情況、有無(wú)神經(jīng)侵犯、術(shù)前癌胚抗原(CEA)水平及TNM分期等。采用電話隨訪或門診復(fù)診的方式，自手術(shù)當(dāng)日起進(jìn)行隨訪，截止時(shí)間為2019年4月30日。記錄患者總生存(overall survival，OS)時(shí)間和無(wú)復(fù)發(fā)生存(recurrence-free survival，RFS)時(shí)間。OS：確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期；RFS：確診之日至局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或最后1次隨訪日期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TRIM14在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

免疫組化檢測(cè)顯示：TRIM14蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，其在CRC組織和癌旁組織中均有表達(dá)，在癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁組織，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)TRIM14在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical analysis of the expression of TRIM14 in colorectal cancer and paracancerous tissues

免疫組化染色評(píng)分：腫瘤組織及癌旁組織TRIM14評(píng)分分別為(9.462±3.735)分和(3.738±1.214)分，腫瘤組織評(píng)分顯著高于癌旁組織(t=16.554，P<0.01)。

2.2 TRIM14表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)腫瘤組織免疫組化評(píng)分判定TRIM14在75例CRC組織中呈高表達(dá)(評(píng)分>6分)，高表達(dá)率為58.14%(75/129)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CRC組織中TRIM14高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯及TNM分期顯著相關(guān)(均P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度及術(shù)前CEA水平無(wú)顯著相關(guān)性(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 TRIM14表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n=129)Table 1 Relationship between TRIM14 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(n=129)

2.3 TRIM14表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)TRIM14組CRC患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著低于低表達(dá)組(P<0.01，圖2A)；高表達(dá)TRIM14組CRC患者的總生存率亦顯著低于低表達(dá)組(P<0.01，圖2B)。

A：無(wú)復(fù)發(fā)生存；B：總生存圖2 結(jié)直腸癌組織中TRIM14表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between TRIM14 expression level and prognosis of patients with colorectal cancer

2.4 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

單因素分析顯示，腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯、TNM分期及TRIM14表達(dá)水平是影響CRC患者RFS和OS的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見(jiàn)表2；進(jìn)一步Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析表明，TNM分期及TRIM14表達(dá)水平是影響患者RFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.01)，見(jiàn)表3。

表2 影響結(jié)直腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素分析Table 2 Univariate analysis of risk factors related to recurrence-free survival and overall survival of colorectal cancer patients

表3 影響結(jié)直腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of risk factors related to recurrence-free survival and overall survival of colorectal cancer patients

3 討論

TRIM家族是一類超大基因家族，包括了75個(gè)家族成員，越來(lái)越多的證據(jù)表明，TRIM家族蛋白與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。對(duì)于CRC，既往研究已發(fā)現(xiàn)TRIM24和TRIM29在CRC組織中顯著上調(diào)，發(fā)揮促癌基因的功能，參與CRC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[12-13]。在本研究中，我們通過(guò)分析了129例CRC組織中TRIM14的表達(dá)水平及其與患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的相關(guān)性，證實(shí)了TRIM14在CRC組織中表達(dá)顯著上調(diào)，并與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯及TNM分期等多種不良臨床病理因素顯著相關(guān)。進(jìn)一步的單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，TRIM14高表達(dá)是影響患者無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存的獨(dú)立預(yù)后因素。上述研究結(jié)果提示，TRIM14在CRC的發(fā)生發(fā)展中也扮演著促癌基因的角色，癌組織中TRIM14高表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后。

TRIM14作為TRIM家族的重要一員，既往研究報(bào)道其主要在機(jī)體的先天性免疫調(diào)節(jié)[14]和免疫抗感染[15]等方面發(fā)揮重要功能。最近，其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值逐漸被研究者關(guān)注[5-10]。Dong等[5]研究發(fā)現(xiàn)TRIM14在肝癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，其高表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、血管侵犯，TNM分期和巴塞羅那肝癌分期密切相關(guān)，進(jìn)一步分析表明TRIM14高表達(dá)是影響肝癌患者OS和RFS的獨(dú)立預(yù)后因素；Xu等[6]研究表明TRIM14在人骨肉瘤組織和細(xì)胞系中上調(diào)，并與骨肉瘤患者較短的無(wú)進(jìn)展生存期和OS相關(guān)；Tan等[9]發(fā)現(xiàn)TRIM14在膠質(zhì)瘤標(biāo)本(包括組織和細(xì)胞系)中過(guò)表達(dá)，并且高水平的TRIM14預(yù)示著患者的預(yù)后不良；此外，杜天明等[10]分析TRIM14在189例胃癌組織中的表達(dá)水平及其臨床意義，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在mRNA還是在蛋白水平，癌組織中的TRIM14表達(dá)均明顯高于癌旁組織，其表達(dá)水平是影響胃癌患者無(wú)瘤生存期和OS的獨(dú)立因素。結(jié)合本研究結(jié)果，提示TRIM14可促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展進(jìn)而影響患者的臨床預(yù)后，檢測(cè)其表達(dá)水平可作為判斷CRC患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

關(guān)于TRIM14促進(jìn)CRC進(jìn)展的潛在分子機(jī)制，目前研究仍較少。Jin等[16]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)表明，TRIM14可通過(guò)激活SPHK1/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力；Shen等[17]通過(guò)一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TRIM14可通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)促進(jìn)AKT通路的磷酸化進(jìn)而增強(qiáng)CRC細(xì)胞的增殖能力和抑制其凋亡，介導(dǎo)CRC的發(fā)生和發(fā)展。在其他類型腫瘤中，Xu等[6]發(fā)現(xiàn)TRIM14可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移和侵襲；在乳腺癌中，TRIM14可通過(guò)抑制SHP-1的表達(dá)進(jìn)而激活p-STAT3通路，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[8]；此外，TRIM14可通過(guò)穩(wěn)定Dvl2從而激活Wnt/β-catenin通路來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的化療耐藥[9]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，我們推測(cè)TRIM14可能通過(guò)多種機(jī)制或與其他分子相互作用促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而發(fā)揮其促癌活性。

綜上所述，本研究顯示TRIM14在CRC組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其高表達(dá)與CRC多種不良臨床病理特征及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評(píng)估CRC患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。對(duì)TRIM14在CRC中的具體作用機(jī)制、信號(hào)通路及潛在抗腫瘤效應(yīng)的深層次研究，有望為揭示CRC轉(zhuǎn)移機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供新思路。