呂冰潔， 安 超， 郝 東， 王 濤， 王曉芝， 李洪波， 楊 陽(yáng)

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，2臨床營(yíng)養(yǎng)科，3全科醫(yī)學(xué)科，山東濱州256603）

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的約 80%［1］。盡管早期檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)治療取得了進(jìn)展，但NSCLC 在確診時(shí)常常為晚期且預(yù)后不良［2］，因此，揭示NSCLC的分子機(jī)制和鑒定新的生物標(biāo)志物可能對(duì)NSCLC的診斷和治療非常重要。

鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）可將鞘氨醇轉(zhuǎn)化為鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P），后者是一種重要的在腫瘤發(fā)生中調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的生物活性脂質(zhì)介體［3］，因此，SphK 也可能在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2 種功能性SphK 同種型（SphK1 和SphK2）已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被鑒定和描述特征［4］。研究顯示，許多腫瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌和結(jié)腸癌）存在SphK1 的過(guò)度表達(dá)，且其與腫瘤的發(fā)展和患者的生存密切相關(guān)［5-8］。然而SphK1 是否參與NSCLC 的侵襲和轉(zhuǎn)移及其機(jī)制尚不完全明確。Hojjat 等［9］和 Liu 等［10］分別在結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo和HT-29中發(fā)現(xiàn)SphK1可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與ERK1/2 信號(hào)通路的激活有關(guān)，故我們猜測(cè)SphK1 可以促進(jìn)NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移，且這種作用可能與激活ERK1/2 信號(hào)通路有關(guān)。因此，本研究檢測(cè)了SphK1 在NSCLC 臨床標(biāo)本中的表達(dá)，觀察了SphK1 在NSCLC 細(xì)胞侵襲和遷移中的作用，并試圖揭示其潛在機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 臨床標(biāo)本 本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集31 名NSCLC 患者腫瘤組織和匹配的正常肺組織。這些患者術(shù)前均未接受任何化療或放療。這些組織樣本立即在液氮中儲(chǔ)存或用甲醛固定以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.1 mg/L 鏈霉素和1×105U/L 青霉素的DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑和儀器 ERK1/2 抑制劑U0126（Cell Signaling Technology）以 20 μmol/L 預(yù)處理 A549 細(xì)胞 30 min；用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理對(duì)照組?？?SphK1、E-cadherin、fibronectin 和 β-actin抗體及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的 II 抗購(gòu)自 Santa Cruz；抗 p44/42 MAPK（ERK1/2）和p-ERK1/2 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；TRIzol 試劑、cDNA 合成試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。NanoDrop 2000 分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Scientific。

2 主要方法

2.1 RT-qPCR 根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol試劑提取總RNA；通過(guò)NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度；使用cDNA 合成試劑盒將2 μg總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。SphK1 的上游引物序列為5'-GGCTGCTGTCACCCATGAA-3'，下游引物序列為5'-TCACTCTCTAGGTCCACATCAG-3'；β-actin 的上游引物序列為5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3'，下游引物序列為5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'。RT-qPCR 條件如下:95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。最后，使用2-ΔΔCt法計(jì)算SphK1相對(duì)于β-actin的mRNA表達(dá)水平。

2.2 Western blot 實(shí)驗(yàn) 使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液提取細(xì)胞裂解物，通過(guò)BCA 法評(píng)估總蛋白質(zhì)的濃度。使用SDS-PAGE 凝膠分離等量的蛋白質(zhì)，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。使用TBST［10 mmol/L Tris（pH 7.4）、100 mmol/L NaCl和5%Tween-20］中稀釋的5%牛血清白蛋白封閉PVDF 膜，加入I 抗［抗SphK1 抗體（1∶500），抗 E-cadherin 抗體（1∶500），抗 fibronectin 抗體（1∶250），抗p44/42 MAPK（ERK1/2）抗體（1∶1 000），抗p-ERK1/2抗體（1∶1 000），抗β-actin 抗體（1∶1 000）］4℃孵育過(guò)夜。將膜與HRP 標(biāo)記的II抗在室溫下孵育1 h，ECL顯影。顯影結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0 進(jìn)行圖像分析。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)于SphK1 的過(guò)表達(dá)，我們委托GenePharma 公 司構(gòu)建含SphK1基因的 pcDNA3.1 載體pcDNA3.1-SphK1（SphK1 組），以空pcDNA3.1 載體為陰性對(duì)照（NC組）。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Lipofectamine? 2000 試劑將 pcDNA3.1-SphK1 載體或空 pcDNA3.1 載體轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞，48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于SphK1的敲減，我們?cè)O(shè)計(jì)靶向SphK1基因的siRNA（siSphK1 組），其序列為5'-GCAGGCAUAUGGAGUAUGA-3'，以亂序 siRNA 為陰性對(duì)照（siNC組）。使用 Lipofectamine? 2000 試劑將 siSphK1 或siNC轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。48 h后，細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)于具有Transwell 小室的24 孔板中進(jìn)行，小室底部為孔徑8 μm 的有孔聚乙烯膜（Costar）。用50 μL Matrigel（1 mg/L）包被Transwell小室底部膜的內(nèi)表面，調(diào)整細(xì)胞密度為 1.0×105個(gè)將 200 μL 含 1% FBS 的細(xì)胞懸液置于上室，24 孔板下室加入 600 μL 含 30%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的潮濕環(huán)境中溫育16 h。16 h 后，非侵入性的細(xì)胞用棉簽移除，穿過(guò)涂有Matrigel 的膜向下遷移的細(xì)胞用4%甲醛固定和結(jié)晶紫染色，然后在光學(xué)顯微鏡（×200）下拍照。選擇7個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)以反映細(xì)胞侵襲能力。除未在Transwell 小室底部膜表面鋪Matrigel，遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)方法一致。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。使用SPSS 17.0 軟件分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SphK1在NSCLC組織中高表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與癌旁肺組織相比，NSCLC組織中SphK1 的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。為了分析 31 例 NSCLC 患者 SphK1 mRNA 表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，基于1.5 倍上調(diào)的截?cái)嘀?，將樣本分? 組:SphK1 高表達(dá)組（n=17）和SphK1 低表達(dá)組（n=14）。晚期NSCLC 患者的SphK1表達(dá)水平顯著升高（P=0.012），而SphK1表達(dá)水平在患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤組織學(xué)類型和吸煙狀況等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。另外，RT-qPCR 結(jié)果表明，SphK1 的 mRNA 表達(dá)水平隨著腫瘤TNM 分期進(jìn)展而增加，IV 期最高，I 期最低（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

2 SphK1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SphK1 載體可使A549 細(xì)胞過(guò)表達(dá)SphK1，而siSphK1則抑制A549細(xì)胞中SphK1表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)圖2A、B。過(guò)表達(dá) SphK1 可促進(jìn) A549細(xì)胞的侵襲和遷移（P＜0.01），而敲減SphK1則抑制了A549細(xì)胞的侵襲和遷移（P＜0.05），見(jiàn)圖2C、D。

Figure 1.Correlation between SphK1 expression and NSCLC progression.A:the mRNA expression of SphK1 in NSCLC tissues and adjacent lung tissues（n=31）；B:the mRNA expression of SphK1 in NSCLC tissues at I/II（n=14）and III/IV（n=17）stages.Mean±SD.**P＜0.01 vs adjacent tissues；##P＜0.01 vs I/II stages.圖1 SphK1對(duì)NSCLC進(jìn)展的影響

表1 NSCLC患者不同SphK1水平臨床病理參數(shù)比較Table 1.Correlation analysis between SphK1 level and clinicopathological parameters in NSCLC patients

Figure 2.SphK1 promoted invasion and migration of NSCLC cells.A:the protein level of SphK1 was detected by Western blot analysis；B:SphK1 mRNA level was detected by RT-qPCR；C:effect of SphK1 on migration of A549 cells；D:effects of SphK1 on invasion of A549 cells.Scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs siNC group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.圖2 SphK1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移

3 ERK1/2 途徑參與細(xì)胞侵襲和遷移，并調(diào)節(jié)上皮-間 充 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化（epithelial-mesenchymal trasition，EMT）相關(guān)基因的表達(dá)

A549 細(xì)胞中 siSphK1 轉(zhuǎn)染減少 fibronectin 表達(dá)，增強(qiáng) E-cadherin 表達(dá)，并降低 ERK1/2 活化；而 SphK1過(guò)表達(dá)降低E-cadherin表達(dá)，增強(qiáng)fibronectin表達(dá)，并誘導(dǎo)ERK1/2活化（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

4 ERK1/2 參與調(diào)節(jié) E-cadherin 和 fibronectin 表達(dá)及細(xì)胞侵襲和遷移

20 μmol/L U0126顯著抑制了SphK1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的 ERK1/2 磷酸化水平；與 DMSO 處理的 SphK1 組相比，U0126處理后fibronectin 表達(dá)顯著下調(diào)，而E-cadherin 表達(dá)顯著上調(diào)，見(jiàn)圖4A。此外，抑制ERK1/2 信號(hào)通路顯著抑制了A549 細(xì)胞的侵襲和遷移（P＜0.05），見(jiàn)圖4B、C。

討 論

作為SphK 家族的一個(gè)重要成員，SphK1 在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)中起著重要作用，在不同的腫瘤中均觀察到SphK1 的過(guò)表達(dá)［5-7］。據(jù)報(bào)道，NSCLC 組織中SphK1 的表達(dá)顯著增加，并與NSCLC患者的腫瘤進(jìn)展和較差的存活率相關(guān)［11］。與之一致，本研究亦觀察到SphK1 在NSCLC 組織中高表達(dá)且在晚期TNM 階段表達(dá)更高，表明SphK1 在NSCLC進(jìn)展中起著重要作用。

SphK1 在腫瘤的多種細(xì)胞過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)乳腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌細(xì)胞的增殖［7-8］。進(jìn)一步研究表明，SphK1促進(jìn)結(jié)腸癌、肝癌和卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移［5，12］，提示 Sphk1 可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究觀察了SphK1在NSCLC 細(xì)胞中的作用，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SphK1 可增強(qiáng)NSCLC 細(xì)胞的侵襲和遷移，而敲減SphK1則顯著抑制了侵襲和遷移，這也進(jìn)一步證實(shí)SphK1 是NSCLC 侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。

EMT 反映了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移表型，并促進(jìn)了包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［13-14］。也有研究顯示SphK1 在結(jié)腸癌HTC116 細(xì)胞EMT 過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14］。我們?cè)诜伟┘?xì)胞中也觀察到類似的變化，SphK1過(guò)表達(dá)抑制了肺癌細(xì)胞的遷移，上皮細(xì)胞連接蛋白E-cadherin 減少，間充質(zhì)標(biāo)志物fibronectin 增加。ERK1/2 作為預(yù)防和治療與EMT 相關(guān)的轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在靶標(biāo)已受到廣泛關(guān)注［15］，該通路也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和EMT 的途徑之一［13］。許多類型的癌癥（包括肺癌）中的p-ERK1/2 水 平 升 高［16-17］。 而 SphK1對(duì)肺癌細(xì)胞中ERK1/2 信號(hào)通路的影響尚不明確。本研究結(jié)果顯示，SphK1 的過(guò)表達(dá)刺激了ERK1/2 信號(hào)通路的激活，而敲減SphK1減弱了ERK1/2 信號(hào)通路的激活，表明SphK1 影響NSCLC 細(xì)胞中ERK1/2 信號(hào)通路途徑的激活。ERK1/2 通路在肺癌組織中經(jīng)常失調(diào)，并且在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［18］。本研究還發(fā)現(xiàn)，抑制ERK1/2途徑減弱了SphK1介導(dǎo)的EMT 相關(guān)基因表達(dá)變化及細(xì)胞的侵襲和遷移，表明SphK1可能通過(guò)ERK1/2 途徑調(diào)節(jié)NSCLC 細(xì)胞的EMT 過(guò)程及侵襲和遷移，靶向ERK 途徑的藥物或許可用于治療過(guò)表達(dá)SphK1的肺癌。

Figure 3.SphK1 was involved in the regulation of p-ERK1/2，E-cadherin and fibronectin protein levels.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.05 vs siNC group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.圖3 SphK1參與調(diào)節(jié)p-ERK1/2、E-cadherin和fibronectin蛋白水平

Figure 4.ERK1/2 was involved in the regulation of E-cadherin/fibronectin expression（A），cell migration（B）and cell invasion（C）.The A549 cells were pretreated with U0126（20 μmol/L）or DMSO for 30 min.Scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC+DSMO group；#P＜0.05 vs NC+U0126 group.圖4 ERK1/2參與調(diào)節(jié)E-cadherin和fibronectin表達(dá)及細(xì)胞遷移和侵襲

綜上所述，SphK1 可能通過(guò)ERK1/2 途徑調(diào)節(jié)NSCLC 細(xì)胞中的EMT 過(guò)程，并促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的侵襲和遷移。