吳迪 朱素芹 張語卉

摘要：赤霉病是我國小麥重要病害之一，禾谷鐮刀菌是其主要致病因子。赤霉病菌在侵染小麥過程中會(huì)在籽粒中產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素（DON）。維生素E的抗氧化作用在一定程度上能降低DON的毒性，HGGT（尿黑酸牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶）是維生素E生物合成的關(guān)鍵限速酶。為了揭示HGGT基因與小麥赤霉病及DON毒素積累的關(guān)系，本研究克隆HGGT基因的全長，并開發(fā)了基因特異標(biāo)記，在31份小麥品種中進(jìn)行標(biāo)記分析，明確了該基因的分布。同時(shí)采用雙花滴注法在揚(yáng)花期對(duì)31份小麥品種進(jìn)行赤霉病接種和抗性鑒定，成熟期利用LC-MS法測定籽粒中DON毒素含量。結(jié)果表明，HGGT基因與赤霉病抗性相關(guān)，攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素含量顯著（P<0.05）低于不攜帶該基因的品種，說明HGGT基因可以用于改良小麥赤霉病抗性，并降低籽粒毒素含量。

關(guān)鍵詞：小麥;赤霉病;DON毒素;HGGT基因;維生素E

中圖分類號(hào)： S435.121.4+5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）11-0096-04

收稿日期：2020-04-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31771772）。

作者簡介：吳 迪（1992—），男，江蘇揚(yáng)州人，碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：956671930@qq.com。

通信作者：李 韜，博士，教授，主要從事小麥赤霉病遺傳和種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：taoli@yzu.edu.cn。 ?小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌引起的一種麥類真菌病害。赤霉病抗性類型主要分為抗侵染、抗擴(kuò)展、籽粒抗性和抗毒素積累。小麥赤霉病多發(fā)生在溫暖多雨和氣候濕潤地區(qū)[1]，近年來，我國小麥赤霉病發(fā)生區(qū)域由長江流域向黃淮流域不斷北移[2]，主要發(fā)生在長江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)[3]。禾谷鐮刀菌侵染小麥后造成穗部組織褐化壞死，籽粒干癟，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4-5]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。小麥赤霉病的另一大危害是感病籽粒中積累的毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）[6-7]，人畜中毒后會(huì)出現(xiàn)胃部不適，惡心眩暈、頭痛[8]，故又稱嘔吐毒素，還會(huì)造成神經(jīng)危害，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)[9]。小麥赤霉病不僅造成糧食減產(chǎn)，還在侵染過程中積累毒素，造成嚴(yán)重的食品安全隱患[10]。因此赤霉病引起的食品和飼料污染問題引起了人們的極大關(guān)注。我國衛(wèi)生和標(biāo)準(zhǔn)管理部門規(guī)定，小麥和玉米中DON含量超過1 mg/kg、小麥赤霉病病粒含量超過4%時(shí)則禁止食用[11]。

維生素E是一種重要的抗氧化劑，可分為生育酚和生育三烯酚兩大類[12]。小麥中的生育酚主要存在于胚中，生育三烯酚存在于果皮和胚乳中[13]。維生素E的生物合成途徑包括：（1）親水性頭部的合成。（2）HGA的植基化。HGA分別在尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶（HPT）和尿黑酸牻牛兒基牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶（HGGT）的催化下生成生育酚和生育三烯酚的前體物[14]。（3）MPBQ（2-甲基-6-植基-苯醌）和MGGBQ（2-甲基-6-牻牛兒牻牛兒基-苯醌）的甲基化。（4）環(huán)化反應(yīng)[15]。HGGT基因定位于質(zhì)體中，主要在小麥胚乳中表達(dá)。HGGT是維生素E生物合成的關(guān)鍵酶基因[16]，Cahoon等于2003年第一次從大麥和水稻種子中克隆得到HGGT序列[17]。小麥籽粒積累DON毒素后，活性氧（ROS）含量提高，抗氧化能力下降，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體和細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷[18]。維生素E是一種強(qiáng)自由基清除劑，能及時(shí)清除活性氧，防止脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生[19]。在飼料中添加維生素E能降低DON的毒性作用，在膳食中使用維生素E能緩解DON引起的急性中毒[20]，但維生素E對(duì)DON的降毒機(jī)制尚不清楚。HGGT是生育三烯酚合成的第一個(gè)限速關(guān)鍵酶，也是維生素E合成的第一個(gè)分支點(diǎn)[21]。本試驗(yàn)的主要目的是在31份小麥品種中擴(kuò)增HGGT基因，接種赤霉菌鑒定病小穗率，并測定籽粒中的毒素含量，解析HGGT基因與小麥赤霉病抗性、病小穗率及毒素含量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

31份小麥材料為：NIL-7、R75、NIL-8、S98、R22W、臺(tái)灣小麥、S22V、蘇麥3號(hào)、寧7840、望水白、Clark、黃方柱、海鹽種、N553、S42、CHOKWANG、黃蠶豆、中國春、安農(nóng)8455、Wheaton、寧玉白、Bobwhite、Tokai66、Jagger、白三月黃、科龍199、W7984、菜籽黃、揚(yáng)麥158、Fielder、NP160。所有材料均于2018年10月種植于揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)田，每個(gè)品種播種6行，每行15株。

1.2 小麥基因組DNA提取

苗期取31份材料的嫩葉，采用CTAB法[22]提取各材料的基因組DNA。用超微量分光光度計(jì)檢測出的DNA濃度均在600 ng/μL左右，D260 nm/D280 nm處于1.7～2.0之間。

1.3 HGGT基因引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

通過GenBank網(wǎng)站找到HGGT基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)HGGT基因的特異擴(kuò)增引物（由華大基因公司合成）。

以上述提取獲得的小麥基因組DNA為模板，Seq400.6-2F/Seq400.6-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定HGGT基因在小麥赤霉病不同抗性品種中的分布。PCR反應(yīng)采用50 μL體系：上下游引物各1 μL，DNA模板10 μL，2×Gflex Buffer 25 μL，ddH2O 12 μL，TKs Gflex酶1 μL。PCR反應(yīng)在Thermal Cycler C1000 Touch PCR儀上進(jìn)行，程序如下：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸210 s，37個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃ 保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測帶型，以確定其基因型。

1.4 PDA培養(yǎng)基的配制

稱取40 g馬鈴薯瓊脂糖（PDA）培養(yǎng)基于1 L燒杯中，加入1 L的ddH2O，用玻璃棒攪拌均勻，置于微波爐中加熱15 min完全溶解至透明狀，雙層紗布過濾至錐形瓶中，高溫高壓滅菌鍋121 ℃滅菌 20 min，待溫度降至55 ℃時(shí)，于無菌操作臺(tái)下傾注平板，配制25 mL的等量PDA培養(yǎng)基于9 cm直徑的無菌培養(yǎng)皿中，待PDA培養(yǎng)基完全凝固后置于 25 ℃ 培養(yǎng)箱貯藏備用。

1.5 試驗(yàn)用菌株及其菌液制備

本試驗(yàn)所用禾谷鐮刀菌菌株為F1312（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳懷谷研究員提供）。利用滅菌后的接種環(huán)挑取純菌株斜面上的禾谷鐮刀菌邊緣菌體，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用滅菌后直徑7 mm的圓形打孔器從經(jīng)過活化的禾谷鐮刀菌菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上，取8塊菌塊放入80 mL經(jīng)過滅菌的綠豆湯培養(yǎng)基，然后置于搖床上，在 180 r/min、26 ℃下振搖72～120 h，吸取1 μL孢子液，滴到血球計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下測定孢子濃度，然后稀釋或濃縮到接種需要的濃度（1×105個(gè)/mL）。

1.6 赤霉病接種及鑒定

采用雙花滴注法（bilateral florets inoculation method，BFI），在小麥揚(yáng)花期將制備好的菌液注射到倒5小穗雙側(cè)小花的內(nèi)外穎之間，每行接種10個(gè)穗子，記載接種日期，接種后21 d鑒定感病小穗數(shù)，計(jì)算病小穗率（proportion of symptomatic spikelets，PSS）：PSS=感病小穗數(shù)/總小穗數(shù)。

1.7 籽粒中DON含量的測定

1.7.1 實(shí)驗(yàn)儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀（TSQ-Vantage，Thermo Fisher SCIENTIFIC，美國）。

1.7.2 標(biāo)準(zhǔn)液 制備毒素原液DON（FERMENTEK，以色列）用10%乙腈水配制成 100 μg/L 混標(biāo)。

1.7.3 樣品前處理 前處理方法參照靳夢瞳等的方法[23]。利用磨樣機(jī)將麥粒磨碎，稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水溶液，振蕩后超聲30 min，離心5 min后吸2 mL上清于新的 10 mL 離心管，加入150 mg無水硫酸鎂，振蕩吸上清至新的10 mL離心管。加入1 mL正己烷脫脂，離心去除正己烷層，氮?dú)獯蹈墒Ｓ嗌锨逡?，最后乙?水溶液定容至1 mL。渦旋過0.22 μm尼龍濾膜后，進(jìn)樣LC-MS分析。

1.7.4 色譜及質(zhì)譜條件 色譜及質(zhì)譜條件參照靳夢瞳等的方法[23]，略有改進(jìn)。主要參數(shù)如下：

色譜條件：色譜柱選用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃，樣品溫度 5 ℃。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL。采用流動(dòng)相A（甲醇）和流動(dòng)相B（乙酸銨）組成的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序：0 min 20% A-80% B，1 min 20% A-80% B、5.5 min 90% A-10% B，65 min 90% A-10% B、7 min 20% A-80% B。

質(zhì)譜條件：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測。曲線脫溶劑管（CDL）溫度250 ℃，霧化氣體和干燥氣體均為氮?dú)?，流速分別為3.0、15 L/min。碰撞氣為高純氬氣，碰撞誘導(dǎo)解離壓力為230 kPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 HGGT基因的擴(kuò)增

本研究通過BAC克?。ǖ卿浱?hào)：KU641029）獲得HGGT基因，HGGT基因序列包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。其編碼區(qū)包含273個(gè)堿基，編碼80個(gè)氨基酸。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于402 532 nt，第1外顯子分布在401 715～401 828 nt，共114個(gè)堿基，第2外顯子分布在400 820～400 975 nt，共156個(gè)堿基，PolyA信號(hào)位點(diǎn)位于400 620 nt（圖1）。

為了鑒定HGGT基因在小麥赤霉病不同抗性品種中的分布，根據(jù)HGGT基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的帶型，結(jié)果如圖2所示：17份攜帶HGGT基因的品種都能擴(kuò)增2 000 bp目的條帶，其余14份品種中沒有擴(kuò)增條帶。

2.2 不同小麥材料赤霉病病小穗率及籽粒DON含量

測定不同小麥材料的病小穗率及籽粒中的DON含量，結(jié)果（表1）表明，攜帶HGGT基因的17份材料高抗赤霉病，不攜帶HGGT基因的14份材料高感赤霉病。

2.3 2種基因型下的病小穗率及籽粒DON含量的差異

方差分析結(jié)果表明，攜帶HGGT基因與不攜帶HGGT基因的品種之間病小穗率存在差異，P=000<0.05;攜帶HGGT基因與不攜帶HGGT基因的品種之間的籽粒DON存在差異，P=0.00<0.05（表2）。說明攜帶HGGT基因與不攜帶HGGT基因的品種之間的病小穗率和籽粒毒素含量均存在差異。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)根據(jù)HGGT基因序列，設(shè)計(jì)特異性標(biāo)記，在31份不同赤霉病抗性小麥品種中利用基因擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的基因，確定HGGT在不同赤霉病抗性品種中的分布。在揚(yáng)花期進(jìn)行赤霉病接種抗性鑒定，后續(xù)測定籽粒中積累的DON毒素含量，結(jié)果表明，HGGT基因只在高抗赤霉病品種中擴(kuò)增出，在感病品種中未擴(kuò)增出目的條帶，且攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素含量較低，與不攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素含量存在顯著差異（P<0.05），這也從側(cè)面說明了籽粒中DON毒素積累的前提是赤霉菌在穗部侵染。說明HGGT基因與赤霉病擴(kuò)展抗性有關(guān)，在一定程度上阻止病原菌在穗部的擴(kuò)展并降低籽粒中積累的DON毒素含量，可以用于改良小麥赤霉病抗性。HGGT基因是維生素E生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶基因，我們推測維生素E對(duì)赤霉病的降毒效應(yīng)，很有可能是受HGGT基因調(diào)控的作用，后續(xù)將進(jìn)一步研究HGGT基因相關(guān)的功能以及HGGT基因?qū)Τ嗝?/p>

病的抗性機(jī)制。赤霉菌在揚(yáng)花期和抽穗期都會(huì)侵染小麥，會(huì)在籽粒中積累DON毒素。本研究結(jié)果證明了攜帶HGGT基因的小麥品種病小穗率及籽粒毒素積累量較低，說明HGGT基因具有赤霉病抗性作用，豐富了HGGT基因功能的認(rèn)識(shí)，為小麥赤霉病病小穗率及DON毒素防控提供新的方向，對(duì)解析擴(kuò)展抗性的機(jī)制和DON毒素方面的研究具有重要的參考價(jià)值。

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