王亞月，薛松，周慶峰，裴冬麗

1 商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000

2 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023

有機(jī)鹵代物因其優(yōu)良的熱傳導(dǎo)性、絕緣性、耐熱性、親油性及生物活性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于工、農(nóng)、醫(yī)等生產(chǎn)領(lǐng)域，給社會發(fā)展帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。然而，由于大量生產(chǎn)和不當(dāng)使用，越來越多的鹵代物被排放到環(huán)境各處而逐漸惡化生態(tài)環(huán)境。加之鹵代物的化學(xué)性能非常穩(wěn)定，導(dǎo)致其在天然條件下難以被降解，因此在環(huán)境中的積累越來越多，進(jìn)而可通過食物鏈濃縮、累積于生物體中，呈現(xiàn)“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)，極大地威脅著人類健康，已成為全世界關(guān)注的問題[4]。

微生物作為自然界中主要分解者，將復(fù)雜的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為簡單的化合物，從而保持生命元素的循環(huán)往復(fù)。生長在被有機(jī)鹵代物污染環(huán)境中的微生物具有潛在的轉(zhuǎn)化這些化合物的能力，即其細(xì)胞內(nèi)應(yīng)存在催化脫鹵作用的酶，這類酶被稱為脫鹵酶。其中2-鹵代酸脫鹵酶是催化2-鹵代酸脫鹵水解形成相應(yīng)2-羥基酸的一類水解型脫鹵酶 (圖1)，不僅能夠以一種低能耗途徑降解環(huán)境中的有毒污染物，而且底物譜廣，催化效率高，并具有高效手性拆分特性，可用于獲得光學(xué)純2-鹵代物和2-羥基取代物，因而在環(huán)境修復(fù)與手性化學(xué)品的綠色制造領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用價值。文中將從酶的來源與分類、酶分子結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制、催化特性及應(yīng)用進(jìn)展對2-鹵代酸脫鹵酶進(jìn)行詳述。

1 2-鹵代酸脫鹵酶來源與分類

圖1 2-鹵代酸脫鹵酶催化反應(yīng)式Fig.1 Dehalogenation catalyzed by 2-haloacid dehalogenase[2].

2-鹵代酸脫鹵酶產(chǎn)生菌廣泛存在于自然界的各種環(huán)境中，早在20世紀(jì)80年代后期就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)報道，隨后越來越多的酶相繼被發(fā)掘。目前分離獲得的2-鹵代酸脫鹵微生物已遍布于原核生物和真菌，其中原核生物包括假單胞菌屬Pseudomonas[5]、土壤桿菌屬Agrobacterium[6]、固氮菌屬Azotobacter[7]、根瘤菌屬Rhizobium[8]、莫拉克斯氏菌屬M(fèi)oraxella[9]、硫化葉菌屬Sulfolobus[10]、黃桿菌屬Xanthobacter[11]、副球菌屬Paracoccus[12]、產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes[13]、伯克霍爾德菌屬Burkholderia[14]、火球菌屬Pyrococcus[15]、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium[2]、冷單胞菌屬Psychromonas[16]、紅桿菌屬Rhodobacteraceae[1]、假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas[17]、副球孢子菌屬Paracoccidioides[18]、克雷白氏桿菌屬Klebsiella[19]、桿菌屬Ancylobacter[20]、芽孢桿菌屬Bacillus[21]與嗜冷單胞菌Psychromonas[22]；真菌包括綠僵菌屬M(fèi)etarhizium、鐮刀菌Fusarium與白僵菌Beauveria[23]，其中假單胞菌屬所占比例最高。從分離環(huán)境上講，大多數(shù)脫鹵微生物分離自陸生環(huán)境，僅有少數(shù)來自于海洋環(huán)境[1,5,12,16,24-25]。由于海洋環(huán)境高壓、高鹽、低溫及寡營養(yǎng)等獨(dú)特性質(zhì)，被認(rèn)為是生命活動的極端環(huán)境，因此生活在這一特殊環(huán)境中的微生物，在基因組成和生態(tài)功能上表現(xiàn)出多樣性和特異性[26]。相應(yīng)地，微生物生理生化特征與胞內(nèi)酶也表現(xiàn)出多樣性和特異性，是發(fā)現(xiàn)新酶的重要源泉。

2-鹵代酸脫鹵酶可以依據(jù)序列保守性和立體選擇性進(jìn)行分類[27]。根據(jù)其底物選擇性和產(chǎn)物構(gòu)型，可分為4種 (表1)，包括D-2-鹵代酸脫鹵酶 (D-DEX)、L-2-鹵代酸脫鹵酶 (L-DEX)、構(gòu)型翻轉(zhuǎn)型DL-2-鹵代酸脫鹵酶 (DL-DEXi) 和構(gòu)型保留型DL-2-鹵代酸脫鹵酶 (DL-DEXr)。根據(jù)氨基酸序列同源性，2-鹵代酸脫鹵酶又可以被分為Group Ⅰ與Group Ⅱ兩類酶。Group Ⅰ類酶包括D-DEX與DL-DEX；Group Ⅱ類酶僅包括L-DEX。在本綜述中，采用第一種分類方法。

表1 2-鹵代酸脫鹵酶的種類Table 1 Types of 2-haloacid dehalogenases

2 2-鹵代酸脫鹵酶結(jié)構(gòu)特征和催化特性

2-鹵代酸脫鹵酶結(jié)構(gòu)的多樣性決定了其功能多樣性，不同類型2-鹵代酸脫鹵酶在結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理上也有所不同。

2.1 L-DEX

2.1.1 結(jié)構(gòu)特征和催化機(jī)理

L-DEX酶類專一性地作用于L-2-鹵代酸產(chǎn)生D-2-羥基酸，在自然界中普遍存在，是目前研究最為透徹的一類2-鹵代酸脫鹵酶[23,28-29]。至今已解析多種來源的L-DEX及其與底物復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，如來自于假單胞菌Pseudomonassp.strain YL的L-DEX YL[30]，自養(yǎng)黃桿菌Xanthobacter autotrophicusGJ10的DhlB[31]，掘越氏火球菌Pyrococcus horikoshiiOT3的PH0459[15]，洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia cepaciaMBA4的DehIVa[32]，硫化葉菌Sulfolobus tokodaii的DehSft[33]與紅桿菌Rhodobacteraceae的DehRhb[1]。L-DEX是α/β類型水解酶，但并不屬于α/β水解酶折疊家族。其含有典型的Rossmann-fold-like核心域：6股β-sheets以321456的順序平行排列，由5股α-helices連接β-sheets形成的3層α/β折疊單元構(gòu)成三明治結(jié)構(gòu)域[30,34-35]。不同于α/β水解酶折疊家族典型的結(jié)構(gòu)域，即8股β-strands以12435678的順序排列，且β2-strands反平行于其他鏈，從第3股鏈開始，兩條鏈之間由α-helix連接，形成β/α/β單元，第一個α-helix和最后一個α-helix位于β-sheet的一側(cè)，其余α-helix位于另一側(cè)[36]。其中除了PH0459晶體結(jié)構(gòu)為單體，其他L-DEX晶體結(jié)構(gòu)均為二聚體。除DhlB由一個核心結(jié)構(gòu)域、兩個亞結(jié)構(gòu)域組成外，其他L-DEX都是由一個核心結(jié)構(gòu)域與一個亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，活性位點(diǎn)位于兩個結(jié)構(gòu)域間 (圖2)。通過X-射線晶體衍射、O18同位素標(biāo)記、液質(zhì)聯(lián)用、定點(diǎn)突變及量子力學(xué)/分子力學(xué) (QM/MM) 計(jì)算等技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)L-DEX的脫鹵反應(yīng)屬于SN2親核取代反應(yīng)，其活性中心天冬氨酸殘基的羧酸基團(tuán)為親核試劑，攻擊 L-2-鹵代酸的C2原子，形成一個酯中間體，中間產(chǎn)物在由His/Glu (DehRhb中) 或Asn/Ser (DehIVa中) 或Lys (L-DEX YL中) 活化的水分子的進(jìn)攻下水解，離去的鹵素離子主要在Arg或Asn或Phe的輔助下穩(wěn)定 (圖3)，而鹵素離子受體數(shù)量愈多，酶分子愈是可以裂解更強(qiáng)的C-X鍵[37-38]。

圖2 L-DEX晶體結(jié)構(gòu) (A: 來自Xanthobacter autotrophicus GJ10的DhlB[31]; B: 來自Pseudomonas sp.strain YL的L-DEX YL[30])Fig.2 Crystal structure of L-DEX.(A) DhlB from Xanthobacter autotrophicus GJ10[31].(B) L-DEX YL from Pseudomonas sp.strain YL[30].

圖3 L-DEX催化機(jī)制[32]Fig.3 Reaction mechanism of L-DEX[32].

2.1.2 L-DEX催化特性

L-DEX的來源比較廣泛，如陸生和海洋環(huán)境，不同生境來源的L-DEX在酶學(xué)特性上既有相同點(diǎn)又表現(xiàn)出差異。如L-DEX對氯代與溴代底物表現(xiàn)出高的催化活性，對D-2-鹵代酸無降解能力，不能催化氟代與C3位置取代鹵代酸的脫鹵反應(yīng)；除了具有催化長鏈鹵代酸脫鹵特性之外，多數(shù)L-DEX僅對于碳鏈長度為2和3的鹵代酸表現(xiàn)出高的催化活性，而對于碳鏈更長的底物的催化活性很低[5,11-12,39]。但在底物特異性上不盡相同，如L-DEX YL對L-2-氯丙酸的催化轉(zhuǎn)化比氯乙酸好，而來源于芽孢桿菌Bacillusstrain I37c菌株的L-DEX則更偏好于氯乙酸[39-40]。L-DEX最適反應(yīng)pH偏堿性范圍，在pH 9–11之間，L-DEX亞基分子量為25 000–28 000 Da等。但這類脫鹵酶在天然狀態(tài)下，其分子量不盡相同，分別有單聚體、二聚體和四聚體[5,11-12,39]。對來源于不同細(xì)菌的脫鹵酶，其對溫度耐受性也不一致。如陸生來源的惡臭假單胞菌Pseudomonas putida產(chǎn)生的L-DEX最適反應(yīng)溫度為30–45 ℃，55 ℃孵育15 min后，酶活性為原來的50%，熱穩(wěn)定性差；從海冰界面 (-10 ℃)分離的嗜冷單胞菌Psychromonas ingrahamii(Pin)菌株具有嗜冷特性，最低生長溫度-12 ℃，其產(chǎn)生的L-DEX Pin最適反應(yīng)溫度為45 ℃，熔解溫度為85 ℃。L-DEX Pin具有嗜冷酶與嗜熱酶特征，與嗜中溫酶相比，該酶具有更多疏水表面和更多鹽橋[16]。海洋來源的Rhodobacteraceae產(chǎn)生的DehRhb最適反應(yīng)溫度為55 ℃，60 ℃條件下孵育1 h后，活性仍保留在45%左右，表現(xiàn)出適度熱穩(wěn)定性，另外，其催化關(guān)鍵氨基酸為His183和Glu21，不同于陸生來源的L-DEX，可能是以一種新的催化機(jī)制進(jìn)行脫鹵[22]。可見，通過利用海洋環(huán)境及其他極端環(huán)境資源可以開發(fā)更多新型天然脫鹵酶，為認(rèn)識其結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及催化特性提供新知識，同時為L-DEX及其他酶類的定向改造提供理性指導(dǎo)。

2.2 DL-DEX

2.2.1 結(jié)構(gòu)特征和催化機(jī)理

DL-DEX酶類可同時催化2-鹵代酸的兩個對映體脫鹵反應(yīng)，水解產(chǎn)生相應(yīng)的2-羥基酸。根據(jù)產(chǎn)物的構(gòu)型分為構(gòu)型翻轉(zhuǎn)型 (DL-DEXi) 與構(gòu)型保留型 (DL-DEXr)。

DL-DEXi酶類催化底物脫鹵時，C2原子構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，產(chǎn)物構(gòu)型與底物構(gòu)型相反。目前已報道的DL-DEXi包括分離自Pseudomonassp.113的DL-DEX 113[41]、Pseudomonas putidaPP3的DehI[42]與甲基桿菌Methylobacteriumsp.CPA1的DL-DEX Mb[43]。其中后兩者晶體結(jié)構(gòu)已知，DL-DEXi為全α-helix類型蛋白，與L-DEX及水解酶中的其他折疊超家族在結(jié)構(gòu)上并沒有同源性。如圖4所示，為DehI結(jié)構(gòu)圖，其晶體結(jié)構(gòu)為二聚體 (圖4A)，每個單體的N-端 (殘基1–130) 與C-端 (166–296) 序列具有16%的同源性，構(gòu)成了一個pseudo-dimer，活性中心位于每個單體的pseudo-dimer交界面處，可結(jié)合D-型與L-型底物[27](圖4B)。DL-DEXi催化機(jī)制也不同于L-DEX，其通過活化水分子直接攻擊2-鹵代酸的C2原子，斷裂C-X鍵，釋放鹵素離子，脫鹵過程并不涉及共價酯中間體的形成(圖5)[41]。保守的Asp與Asn可能負(fù)責(zé)水分子的活化，然而并沒有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

圖4 來自于Pseudomonas putida PP3的DehI晶體結(jié)構(gòu)[42] (A: DehI二聚體結(jié)構(gòu); B: DehI單體N-端與C-端重復(fù)結(jié)構(gòu)疊合, α-helix在圖中標(biāo)出)Fig.4 Crystal structure of DehI from Pseudomonas putida PP3[42].(A) Ribbon representation of DehI dimer.(B) Image of the superposed N- and C-terminal repeats of DehI.The α-helices are labelled.

圖5 L-DEXi脫鹵反應(yīng)機(jī)理[41]Fig.5 Reaction mechanism of DL-DEXi[41].

DL-DEXr酶類與DL-DEXi催化產(chǎn)物構(gòu)型變換相反，其催化底物脫鹵后，生成的產(chǎn)物構(gòu)型與底物構(gòu)型相同。目前可供參考的DL-DEXr是來自于Pseudomonas putidaPP3菌株，然而該類酶序列信息仍是未知，反應(yīng)機(jī)理也仍未解析[44]。由于DL-DEXr對N-乙馬來酰亞胺與p-對氯汞苯甲酸等巰基破壞試劑高度敏感，因此推測DL-DEXr的巰基基團(tuán)參與催化反應(yīng)，在脫鹵時可能涉及硫酯中間體的形成。如圖6所示，酶與底物作用，底物C2構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，釋放鹵素離子，形成酶-底物硫酯中間體，中間體在水分子的進(jìn)攻下水解，同時C2原子構(gòu)型發(fā)生第二次翻轉(zhuǎn)，生成與底物相同構(gòu)型的產(chǎn)物，但目前還沒有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來支持[44]。

2.2.2 DL-DEX催化特性

圖6 DL-DEXr涉及C2-構(gòu)型保留的可能催化機(jī)理[44]Fig.6 Possible mechanism of DL-DEXr involving the retention of C2-configuration of the substrate[44].

目前已分離鑒定的DL-DEX較少，在酶學(xué)特性表征方面的研究也較少，目前已報道的DL-DEXi多偏好于L-型底物，如分離自Pseudomonas putidaPP3的DehI[42,45]、分離自根瘤菌Rhizobiumsp.RC1的DehE[46]、分離自Pseudomonassp.113的DLDEX 113[45]與來自于木糖氧化產(chǎn)堿桿菌Alcaligenesxylosoxidansssp.denitrificantsDhIIV的DL-DEX ABIV[47]，其中DehI、DehE、DL-DEX 113與DLDEX 113對L-型底物與D-型底物的催化活性之比分別是1.2、1.6、1.4與1.1DL-DEXi對碳鏈長度在2–5的鹵代酸有降解能力，而且能夠降解3-氯乙酸。DL-DEXi包括單體與二聚體，除了DL-DEX YL為單體以外，目前報道酶分子多為同源二聚體，亞基分子量為26 000–36 000 Da[38]。最適反應(yīng)pH范圍為9.5左右，最適反應(yīng)溫度為30–40 ℃[45-46,48]。催化轉(zhuǎn)化底物和產(chǎn)物構(gòu)型保持一致的DL-DEXr，對巰基抑制劑比較敏感，對碳鏈長度為2–4個碳原子的鹵代酸有降解能力[44]。

2.3 D-DEX

2.3.1 結(jié)構(gòu)特征和催化機(jī)理

D-DEX酶類是專一性地催化D-2-鹵代酸脫鹵水解產(chǎn)生L-2-羥基酸的一類酶。目前僅有4種天然來源的D-DEX的一級結(jié)構(gòu)信息可供參考利用，包括來自于根瘤菌Rhizobiumsp.RC1的DehD[49]、來自于土壤桿菌Agrobacteriumsp.strain NHG3的DehII[50]、來自于惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaAJ1的HadD AJ1[51]及來自于假單胞菌Pseudomonassp.ZJU26的DehDIV-R[52]，其中HadD AJ1與DehDIV-R間序列D同源性最高為89%，而HadD AJ1與DehD和DehII NHG3間的同源性相對較低，分別為22.2%和32.6%。作者曾對HadD AJ1結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制進(jìn)行深入研究，解析晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)HadD AJ1與DL-DEXi結(jié)構(gòu)相同，都是全α-helix蛋白，不同于L-DEX的α/β折疊結(jié)構(gòu)。HadD AJ1每個單體均由2個氨基酸序列同源性為20%的重復(fù)構(gòu)成 (圖7)，2個重復(fù)折疊分別由N-端α-helix 1–6與C-端α-helix 7–12組成，中間由1個包含33個氨基酸且含有1個310-helix η1的linker連接 (圖7B)。每個重復(fù)的前3個helices形成了1個three-helix-bundle，后3個helices以three-helix-triangular排布 (圖7A)。兩個重復(fù)折疊通過α6/α12與α4/α10殘基間的范德華力、鹽鍵、氫鍵與疏水相互作用穩(wěn)定。在空間上，螺旋α4與α10彼此平行排列，α6與α12相互交叉在他們中間的凸起處[53]。這種結(jié)構(gòu)上內(nèi)在的重復(fù)對稱折疊在很多蛋白中發(fā)現(xiàn)，可能是由蛋白質(zhì)進(jìn)化中一些遺傳過程如域的融合與裂變及基因復(fù)制等改變引起[54]。

如圖8所示，對HadD AJ1催化機(jī)理研究表明D-DEX酶類的脫鹵反應(yīng)是由水分子直接介導(dǎo)，反應(yīng)過程中沒有酯中間體的形成。其中，D205為關(guān)鍵催化殘基，D205在N131的輔助下共同參與水分子的活化，活化的水分子從正后方進(jìn)攻底物C2原子，斷裂C-X鍵，鹵素離子離去，同時活化的水分子羥基與底物C2原子鍵合，形成L-型乳酸[53]。

圖7 HadD AJ1單體結(jié)構(gòu) (A: HadD AJ1單體飄帶結(jié)構(gòu)圖, 兩個重復(fù)基序repeat 1 (α1-α6) 和repeat 2 (α7-α12)由linker (η1) 連接; B: HadD AJ1單體折疊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu))Fig.7 HadD AJ1 monomer.(A) Ribbon representation of monomeric HadD AJ1 composed of repeat 1 (α1-α6), repeat 2 (α7-α12) and a linker (η1).(B) Topological model of HadD AJ1 fold.

圖8 D-DEX催化機(jī)理Fig.8 Reaction mechanism of D-DEX.

2-鹵代酸脫鹵酶中，D-DEX與DL-DEXi氨基酸序列間具有較高同源性，結(jié)構(gòu)上亦是如此，并且兩者催化脫鹵都是由水分子直接介導(dǎo)，不同于L-DEX由酶-底物酯中間體介導(dǎo)的脫鹵反應(yīng)，進(jìn)一步揭示了D-DEX與DL-DEXi在進(jìn)化上有著密切聯(lián)系。

2.3.2 D-DEX催化特性

目前對D-DEX酶類的研究相對較少，這可能與發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)D-DEX的細(xì)菌種類較少有關(guān)。通過對DehD與HadD AJ1生化酶學(xué)特性的表征，發(fā)現(xiàn)D-DEX酶類偏好于催化碳鏈長度在2–4個碳原子的D-2-氯代及溴代酸脫鹵，對溴代底物的催化活性高于對氯代底物的催化活性[51,55]。不同來源的酶作用于相同底物的Km值相差較大，如DehD、HadD AJ1與DehDIV-R催化D-2-氯丙酸脫鹵的Km值分別為0.06 mmol/L、2.2 mmol/L與2.2 mmol/L。與HadD AJ1和DehDIV-R相比，DehD對鹵代底物表現(xiàn)出更高的親和力，而HadD AJ1與DehDIV-R相同的Km值可能歸因于其高度的序列相似性[51-52,55]。在溶液中，D-DEX的存在狀態(tài)也有所不同，DehD以同源二聚體形式存在，而HadD AJ1以同源四聚體形式存在。D-DEX酶類最適反應(yīng)pH在9.0–10.0之間，當(dāng)pH在8.0–10.0范圍之外時，酶活力迅速下降，如HadD AJ1僅表現(xiàn)出低于50%的催化活性。與L-DEX相比，D-DEX酶類呈現(xiàn)嗜中溫特性，最適反應(yīng)溫度50–60 ℃，其熱穩(wěn)定性較差，酶分子在30–40 ℃范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，高于40 ℃時，隨著溫度的升高，酶活性迅速丟失[51-52,55]。

3 2-鹵代酸脫鹵酶的應(yīng)用

2-鹵代酸脫鹵酶可以通過水解脫鹵機(jī)制脫去有機(jī)鹵代羧酸中的鹵素，在脫鹵過程中可以不需另加還原力即可以一條簡單的途徑進(jìn)行生物減毒，在有機(jī)鹵化物污染的環(huán)境中起到生物修復(fù)的作用；同時，鹵代酸脫鹵酶還可以高度立體選擇性地催化脫鹵反應(yīng)，用于獲得小分子的手性羥基酸與鹵代酸，這些小分子有機(jī)酸通常是農(nóng)藥、醫(yī)藥及化工合成的中間體，因而，該類酶在環(huán)境修復(fù)及化工合成等領(lǐng)域有著廣泛的用途和巨大的經(jīng)濟(jì)價值[35,56-57]，主要體現(xiàn)在以下三方面。

1) 環(huán)境治理。鹵代羧酸如2-氯丙酸和2,2-二氯丙酸被廣泛用作合成農(nóng)藥和醫(yī)藥的中間體，尤其是手性純2-氯丙酸是合成很多手性藥物的前體[58]。但這些鹵代酸的大量使用和生產(chǎn)過程中的不當(dāng)處置使得它們同時成為了常見的有機(jī)氯環(huán)境污染物。同時鹵代酸也是某些鹵代物如1,2-二氯乙烷和殺蟲劑六六六降解的中間產(chǎn)物，由于環(huán)境中這類污染物的降解而導(dǎo)致了環(huán)境中對應(yīng)鹵代酸的污染。這些化合物的積累造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題并威脅著人類健康。2-鹵代酸脫鹵酶可以催化2-氯丙酸和2,2-二氯丙酸脫鹵降解為無毒的羥基酸，在環(huán)境治理方面具有重要應(yīng)用價值。

2) 化工合成領(lǐng)域。脫鹵酶的手性選擇性使其在化工合成領(lǐng)域備受青睞，化學(xué)法合成光學(xué)純化合物常常會涉及到刺激性有毒試劑，得到的光學(xué)純度低且產(chǎn)率不高，而利用酶作為生物催化劑不僅反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好且產(chǎn)率高，可獲得高度光學(xué)純的手性化合物[16]。如L-2-氯丙酸是合成除草劑和殺蟲劑的重要前體，D-DEX可選擇性水解外消旋2-氯丙酸，即水解D-2-氯丙酸而不水解L-2-氯丙酸，分離就可以得到高對映體純度的L-2-氯丙酸[59]。帝國化學(xué)工業(yè)公司 (Imperial Chemical Industries) 也早已在工業(yè)中應(yīng)用HadD AJ1拆分消旋2-氯丙酸獲得具有光學(xué)活性的L-2-氯丙酸，作為農(nóng)藥和消炎藥的合成前體，現(xiàn)已成為手性氯丙酸的主要生產(chǎn)方法[60-61]。英國Astrazeneca公司使用D-DEX拆分rac-CPA獲得L-2-氯丙酸，對映體純度高于90%，該方法也適用于生產(chǎn)其他短鏈?zhǔn)中驭?鹵代酸，規(guī)?？筛哂? 000 t/年[27]。此外，D-2-氯丙酸也是一種重要的化工原料，可以直接用來合成多種醫(yī)藥中間體，尤其可以用于合成營養(yǎng)藥L-丙氨酰-L-谷酰胺、抗結(jié)核病藥物硫乳霉素，利用L-DEX拆分消旋2-氯丙酸即可獲得對映體純度的D-2-氯丙酸[62]。D-乳酸是農(nóng)藥化工領(lǐng)域中一個重要的手性中間體，可用于合成芳香丙酸類除草劑；同時，D-乳酸在醫(yī)藥方面也有廣泛用途，可用于納米粒子或納米纖維用作藥物載體，以及用于合成重要的手性藥物中間體，如D-乳酸甲酯等[63]。解桂秋等曾對來源于嗜熱古菌L-DEX催化轉(zhuǎn)化消旋2-氯丙酸生產(chǎn)D-乳酸的反應(yīng)條件進(jìn)行研究，通過對底物濃度、緩沖液濃度以及酶濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)以0.5 mol/L 2-氯丙酸為底物制備D-乳酸[64]。

3) 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。廣譜除草劑如單氯乙酸與2-氯丙酸可以有效地除去多種雜草，但不幸的是，這些除草劑同時可以除去有經(jīng)濟(jì)價值的農(nóng)作物，因此其使用會給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來大量損失，而構(gòu)建具有抗除草劑性能的農(nóng)作物可以避免這些損失。這就需要向農(nóng)作物中引入編碼脫鹵酶的基因。如Mohamed等將D-2-鹵代酸脫鹵酶dehD基因?qū)霟煵葜凶鳛橐粋€選擇性標(biāo)簽，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因煙草Nicotiana benthamiana具有抗單氯乙酸的活性[65]。另外，脫鹵酶還可用于構(gòu)建生物感應(yīng)器，原位檢測環(huán)境中的有機(jī)鹵代污染物[66]。如在脫鹵酶上融合熒光材料用于細(xì)胞成像[67]，將融合癌細(xì)胞識別肽的脫鹵酶連接到多功能的納米顆粒上用于新的腫瘤診斷和治療技術(shù)的開發(fā)等[68]。

4 展望

雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種2-鹵代酸脫鹵酶，并且對L-DEX、DL-DEXi與D-DEX三類酶的結(jié)構(gòu)信息和催化機(jī)制均有所了解，但對DL-DEXr的研究卻僅是停留在酶學(xué)性質(zhì)表征水平，這進(jìn)一步限制了其應(yīng)用，因此仍需要對其結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制進(jìn)行深入研究。另外，多數(shù)2-鹵代酸脫鹵酶僅對碳鏈長度小于4個碳原子的鹵代酸表現(xiàn)出高催化活性，而對于長鏈鹵代酸僅表現(xiàn)出較弱甚至無催化活性；同時，2-鹵代酸脫鹵酶對有機(jī)溶劑較低的耐受性也限制了其底物譜范圍。另外，為了獲得對映體純的手性產(chǎn)物，化學(xué)酶促收斂工藝常用于鹵代酸脫鹵酶的對映體拆分中，然而在下游分離過程中，酶促反應(yīng)步驟與化學(xué)水解所需的高溫與極端pH不兼容，因此仍然有必要挖掘新型2-鹵代酸脫鹵酶。

酶的立體選擇性也是一直備受關(guān)注的問題，2-鹵代酸脫鹵酶家族成員表現(xiàn)出典型的立體選擇性，但目前對該類酶立體選擇性機(jī)制的認(rèn)識也十分有限。Kondo等通過QM/MM與碎片分子軌道計(jì)算方法研究L-DEX對映體選擇性機(jī)制，證實(shí)L-DEX與D-型底物結(jié)合過程中高的活化能壘阻止了酶作用于D-型底物，然而目前仍不清楚在空間結(jié)構(gòu)上，酶分子是如何調(diào)控其對手性底物的選擇性的[69]。作者通過對D-DEX的立體選擇性機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)活性口袋入口處殘基Leu288通過空間位阻作用控制L-型底物進(jìn)入酶活性中心，調(diào)控著酶的立體選擇性。L288到I的突變使酶催化L-型底物，相比于L288旋轉(zhuǎn)受阻的異丙基，I288側(cè)鏈乙基可自由旋轉(zhuǎn)，使L-型底物進(jìn)入酶活性中心[70]。對于DL-DEXr與DL-DEXi如何催化手性底物脫鹵這一問題仍不清楚。

生物催化劑的立體選擇性使其在光學(xué)純化合物的制備中具有重要的應(yīng)用價值，是綠色化學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一。一種理想的工業(yè)生物催化劑應(yīng)該同時具有高催化活性和專一的立體選擇性，而探索脫鹵酶活性與立體選擇性的分子調(diào)控機(jī)制是人工定制高活性與高立體選擇性酶的前提和基礎(chǔ)。因此，為了定向調(diào)控酶不對稱催化反應(yīng)進(jìn)行的方向與程度，獲得高光學(xué)純度的、具有特殊結(jié)構(gòu)的目標(biāo)產(chǎn)物，有必要對2-鹵代酸脫鹵酶的立體選擇性催化機(jī)制進(jìn)行深入研究。