王雪超，李雨雨，崔玉晗，郭志華，王盛

淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院，山東淄博255400

耳聾是常見的單基因遺傳病，也是常見的出生缺陷之一。據(jù)我國流行病學統(tǒng)計，每1 000個新生兒中就有1～3例聾兒，并且每年以3萬人的速度在增長[1，2]，因此非常有必要應用耳聾基因檢測聯(lián)合聽力篩查來預防耳聾的發(fā)生。目前，國際上共鑒定了97個非綜合征型耳聾基因，152個相關(guān)位點[3]。長期以來，臨床研究主要針對4種常見的耳聾基因，包括GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3[2～5]等進行檢測。近年來，許多研究者開始增加基因檢測種類，如針對9種常見的耳聾基因甚至更多耳聾基因進行檢測[1～5]，以期及早發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變。臨淄地區(qū)二孩政策放開后，出生人口增加35%以上。臨淄地區(qū)自2017年7月開始進行新生兒耳聾基因篩查。本研究采用高通量測序技術(shù)檢測臨淄地區(qū)6 060例新生兒的18個遺傳性耳聾基因的100個位點，全面、快速分析耳聾基因突變情況，為先天性、遲發(fā)性、藥物性耳聾提供治療依據(jù)和預防指導。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年7月～2018年10月在臨淄區(qū)人民醫(yī)院和婦幼保健院出生并自愿接受耳聾基因檢測的6 060例新生兒為研究對象。新生兒中，男3 092例、女2 968例，出生Apgar評分7～10分；母親年齡19～42歲，出生孕周37～41周。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得新生兒監(jiān)護人的知情同意。

1.2 方法 采集出生3～7 d充分哺乳的新生兒足跟血，制成≥8 mm的干血斑，于4 ℃保存。采用Mag Pure Blood DNA LQ Kit提取耳聾血片中的模板基因組DNA，并利用Qubit熒光計(Invitrogen)進行定量分析。采用引物-特異性標簽序列進行多重PCR技術(shù)構(gòu)建DNA文庫并定量，利用One Touch2自動化乳液PCR儀擴增測序模板并使用ES磁珠純化儀進行富集，采用Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit上機測序，進行數(shù)據(jù)分析。共檢測18個基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、MT-RNR1、MT-COI、MT-TL1、MT-TS1、MT-TH、DSPP、GPR98、DFNA5、TMC1、MYO7A、TECTA、DLABLO、COCH、MYO15A、PRPS1)的共100個位點。BioelectronSeq 4000高通量測序儀購于北京博奧生物有限公司。對于陽性位點再使用Sanger測序進行驗證，分析數(shù)據(jù)打印報告。另外，對于純合或復合雜合突變的患兒，再采集父母雙方的外周血進行家系突變位點的驗證。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因單基因突變位點篩查結(jié)果 6 060例受檢新生兒中，共檢出耳聾基因突變者404例，突變攜帶率為6.67%。單基因雜合突變391例，其中GJB2突變攜帶者157例，攜帶率2.59%(157/6 060)；SLC26A4突變攜帶者169例，攜帶率2.79%(169/6 060)；GJB3突變攜帶者18例，攜帶率0.30%(18/6 060)；線粒體耳聾相關(guān)基因突變攜帶者46例，攜帶率0.76%(46/6 060)；MYO7A突變攜帶者1例，攜帶率0.02%(1/6 060)。見表1。

表1 6 060例新生兒耳聾基因單基因突變位點篩查結(jié)果

2.2 兩個及以上耳聾基因位點突變篩查結(jié)果 404例耳聾基因突變者中發(fā)現(xiàn)13例兩個及以上耳聾基因位點突變，突變攜帶率0.21%(13/6 060)。其中，GJB2基因c.299-300delAT純合突變1例，GJB2基因c.235delC/c.299-300delAT復合雜合突變1例、雙雜合突變10例，以及罕見的GJB2/SLC26A4 c.235delC/c.299-300delAT/c.2168A>G三個位點突變1例。見表2。同時，對這些特殊新生兒進行定期隨訪并提供遺傳咨詢和指導，分別采集GJB2基因c.299-300delAT純合突變、GJB2基因c.235delC/c.299-300delAT復合雜合突變、c.235delC/c.299-300delAT/c.2168A>G三個位點突變新生兒父母的外周血，進行Sanger位點驗證，發(fā)現(xiàn)3例基因突變均來自新生兒父母雙方。見圖1。

表2 6 060例新生兒兩個及以上耳聾基因位點突變篩查結(jié)果

注：A為GJB2基因c.299-300delAT純合突變；B為GJB2基因c.235delC雜合突變；C為GJB2基因c.299-300delAT雜合突變；D為SLC26A4基因c.2168A>G雜合突變。

2.3 追蹤隨訪結(jié)果 對6 060例新生兒于出生后3～7 d使用美國產(chǎn)ALG03I(AABR)聽力篩查儀進行聽力篩查，56例新生兒未通過聽力篩查，轉(zhuǎn)診至聽力檢查中心。生后6個月確診聽力異?；純?2例，其中雙耳重度耳聾6例，左耳輕度、右耳重度耳聾4例，左耳重度、右耳中度耳聾2例。12例患兒中，攜帶耳聾基因8例(66.67%)，GJB3基因突變3例，GJB2基因突變4例，SLC26A4基因突變1例。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，引起耳聾的主要原因有遺傳因素(約占60%)和環(huán)境因素[3]。在所有遺傳性耳聾中，約70%為非綜合征型耳聾，其余30%為綜合征型耳聾，即除耳聾外還伴有其他相關(guān)器官或系統(tǒng)疾病[1]。本研究利用高通量測序技術(shù)檢測了6 060例新生兒的18個耳聾基因的100個位點，共發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變404例，突變攜帶率6.67%，高于北京市海淀區(qū)的4.7%[5]、長治地區(qū)的5.15%[6]和珠海市的4.2%[1]。臨淄地區(qū)耳聾基因突變檢出率高于全國大部分地區(qū)，可能與檢測基因位點多、覆蓋面廣、各地遺傳背景存在差異有關(guān)。

6 060例新生兒中，4個常見耳聾基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體基因)的常見20個位點突變攜帶率為4.9%。該攜帶率略高于韓萍等[5]研究的4.7%(北京海淀區(qū)90 816例新生兒，檢測4個常見耳聾基因9個位點)；高于潘麗等[1]研究的4.2%(珠海市9 775例新生兒，檢測4個常見耳聾基因20個位點)；略低于李曉澤等[6]研究的5.15%(長治地區(qū)19 113例新生兒，檢測4個常見耳聾基因9個位點)。這表明檢測相同耳聾基因和位點，所得到的突變攜帶率與全國其他地區(qū)基本一致[4，7，8]。

GJB2基因是導致非綜合征型遺傳性耳聾最常見的突變基因，該基因位于13q11～q12，編碼縫隙連接蛋白26，屬于常染色體隱性遺傳[7]。該基因純合或復合雜合突變可導致雙耳先天性重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾，發(fā)病年齡主要在嬰幼兒期[8]。本次篩查共檢出157例(攜帶率2.59%)GJB2單基因雜合突變、6例雙雜合突變；同時檢出1例純合突變、1例復合雜合突變、1例三個位點突變，對這3例患兒進行重點隨訪，目前患兒均在1～2歲，對聲音反應較好，可能為遲發(fā)性耳聾，建議定期監(jiān)測聽力，如發(fā)現(xiàn)異常需盡早干預。SLC26A4基因位于7q31，編碼穿膜蛋白Pendrin，屬于常染色體隱性遺傳，其突變會導致先天性或遲發(fā)性耳聾，通常伴有前庭水管擴大，建議避免頭部外傷和感冒等[9]。本研究篩查發(fā)現(xiàn)169例(攜帶率2.79%)SLC26A4單基因突變，4例雙雜合突變。GJB3基因位于1p33～35，編碼縫隙連接蛋白31，屬于常染色體隱性或顯性遺傳[10]。本研究篩查發(fā)現(xiàn)18例GJB3基因雜合突變，該突變均關(guān)聯(lián)常染色體顯性遺傳，通常起病于青少年期或成人期，一般表現(xiàn)為進行性高頻聽力受損，少數(shù)患者表現(xiàn)為中重度耳聾[10，11]。線粒體耳聾相關(guān)基因?qū)儆谀赶颠z傳，突變者本人與母系成員均應禁用氨基糖苷類藥物，避免發(fā)生藥物性耳聾[12]。目前線粒體耳聾相關(guān)基因研究最多的為線粒體12SrRNA的1555A>G和1494C>T位點。我們在這兩個位點基礎(chǔ)上增加4個基因的6個位點，共檢出46例(攜帶率0.76%)線粒體耳聾基因單雜合突變，5例雙雜合突變。MT-RNR1 1555A>G突變共有31例，突變攜帶率0.512%，其主要引起藥物性非綜合征型母系遺傳性耳聾，為雙側(cè)性，程度不等，與氨基糖苷類藥物有關(guān)，關(guān)鍵在預防[13～17]。對以上篩查新生兒追蹤隨訪，顯示對聲音反應較好，囑家長注意定期監(jiān)測患兒聽力，避免藥物性耳聾等。聽力異?；純憾@基因攜帶者占66.67%，提示有一部分新生兒雖然攜帶耳聾基因，但現(xiàn)階段對聲音反應較好，與臨床表現(xiàn)不符，可能與環(huán)境因素、遺傳特質(zhì)、藥物性、遲發(fā)性等有關(guān)，而關(guān)鍵在預防[17]。

比較全國其他地區(qū)，如長治地區(qū)、北京市海淀區(qū)、珠海地區(qū)等，臨淄地區(qū)篩查的18個耳聾基因的100個位點，除常見4個耳聾基因熱點突變位點外，我們發(fā)現(xiàn)以下基因位點突變攜帶率相對較高，如GJB2基因c.257C>G 10例(攜帶率0.165%)，SLC26A4基因c.919-18T>G 12例(攜帶率為0.198%、有1例雙雜合突變)、c.697G>C 10例(攜帶率0.165%)，MT-CO1基因m.7444G>A 9例(攜帶率0.149%)。可能由于篩查的位點較多，臨淄地區(qū)新生兒耳聾基因突變總攜帶率為6.67%，高于其他地區(qū)[15～17]。

總之，高通量測序技術(shù)以其全面、快速、準確、高通量的特點，在耳聾基因檢測方面具有廣闊的前景。利用高通量測序技術(shù)篩查新生兒耳聾基因突變，檢測位點多，檢出比率較高，可預防的對象多，能夠盡早對患兒進行干預。對于耳聾基因突變攜帶者建議健康用耳，避免使用耳毒性藥物，再婚育時配偶需行耳聾基因檢測[14，15，17]。同時對孕婦進行耳聾基因篩查，及時發(fā)現(xiàn)耳聾缺陷，避免聾兒出生。另外，通過大規(guī)?；蚝Y查，可以建立本地區(qū)耳聾基因突變位點的分布和發(fā)病情況預測模型，對耳聾防控有實際意義[16]。以上研究數(shù)據(jù)也將為全國其他地區(qū)耳聾基因篩查提供參考。