劉磊，杜攀，王芳，包迪，林立新

湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院，湖北襄陽441100

結(jié)腸癌(CC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病死率居全球惡性腫瘤第三位[1]。CC在我國(guó)消化道腫瘤中發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌[2]。由于早期篩查手段不足，大多數(shù)患者首次確診已發(fā)展為中晚期，失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)[3]。近年來隨著內(nèi)窺鏡檢查的普及，CC早期診斷水平有所進(jìn)步，但是晚期CC患者的預(yù)后仍然很差[4]。因此，尋找有效的治療CC的途徑對(duì)改善患者預(yù)后意義重大。微小RNA(miRNA)為非編碼RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸[5]。miRNA通過與mRNA的3′ UTR結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)，從而介導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展[6]。miR-513b-5p作為miRNA家族中的一員，其在鼻咽癌中低表達(dá)，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[7]。類似研究表明，miR-513a-5p可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的增殖[8]。miR-513a-5p在CC中的作用及其機(jī)制尚未明確。有研究表明，重組人細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在CC中具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[9]，其發(fā)揮作用的上游機(jī)制尚不清楚。2016年7月～2018年7月，本研究觀察了CC組織、細(xì)胞中miR-513b-5p的表達(dá)變化，及miR-513b-5p對(duì)CC細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討相關(guān)機(jī)制，以期為臨床上治療CC提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞及主要實(shí)驗(yàn)材料 選擇2016～2018年本院收治的57例CC患者的CC組織及其癌旁組織，所有患者均經(jīng)病理檢查確診為CC且未接受放化療，手術(shù)切除組織標(biāo)本后，保存于-80 ℃冰箱。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者的書面知情同意。人CC細(xì)胞系HCT116、RKO、SW480、LoVo和SW620細(xì)胞均購(gòu)自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。人結(jié)腸成纖維細(xì)胞(CCD-112CoN細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)ATCC生物生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心。Lipofectamine 2000、空載質(zhì)粒miR-con、過表達(dá)STAT3質(zhì)粒、miR-513b-5p模擬物(miR-513b-5p mimics)和miR-513b-5p抑制劑(miR-513b-5p inhibitors)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。TRIzol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Thermo Fischer公司。PVDF膜、CCK-8試劑盒和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。RIPA裂解緩沖液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。ECL試劑盒購(gòu)于Amersham Pharmacia公司。熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒、野生型STAT3(STAT3-WT)和突變型STAT3(STAT3-MUT)載體購(gòu)于美國(guó)Promega公司。

1.2 CC組織和細(xì)胞中miR-513b-5p檢測(cè) 使用TRIzol法提取CC組織、癌旁組織和CC細(xì)胞、CCD-112CoN細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)純度后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PCR試劑盒操作說明進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。以U6(組織)GAPDH(細(xì)胞)作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 miR-513b-5p表達(dá)抑制對(duì)CC細(xì)胞增殖、遷移的影響觀察 培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。HCT116細(xì)胞分為miR-con組、miR-513b-5p抑制劑組，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-513b-5p inhibitors和miR-con轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將兩組細(xì)胞按照2×103/孔接種于96孔板中。貼壁培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm的吸光度值，以此表示轉(zhuǎn)染后0、1、2、3、4 d的細(xì)胞增殖能力。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。取兩組細(xì)胞，胰酶消化后以1 000 r/min離心3 min，無血清RPMI-1640重懸細(xì)胞沉淀至密度為1×105/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入至Transwell小室上室，下室加入700 μL的含10% FBS的完全培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽輕輕將小室上室表面細(xì)胞擦去，晾干，用結(jié)晶紫溶液染色30 min，PBS洗滌2次，顯微鏡觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野(100×)計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，每個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取均值。

1.4 miR-513b-5p與STAT3的靶向關(guān)系驗(yàn)證 通過生物信息預(yù)測(cè)miR-513b-5p在STAT3上的結(jié)合位點(diǎn)并用PCR對(duì)STAT3上miR-513b-5p的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增片段插入到pmiR-GLO report載體，構(gòu)建STAT3-WT質(zhì)粒。用基因突變技術(shù)將部分核苷酸突變，構(gòu)建STAT3-MUT質(zhì)粒。分別用STAT3-WT、STAT3-MUT質(zhì)粒和miR-513b-5p mimic、miR-con轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，采用Western blotting法檢測(cè)STAT3蛋白。

1.5 STAT3過表達(dá)對(duì)CC細(xì)胞增殖、遷移的影響觀察 取部分HCT116細(xì)胞，分為miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-513b-5p模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-513b-5p mimics)、STAT3過表達(dá)組(共轉(zhuǎn)染STAT3過表達(dá)質(zhì)粒和miR-513b-5p mimics)。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。

2 結(jié)果

2.1 CC組織和細(xì)胞中miR-513b-5p表達(dá)變化 CC組織和癌旁組織中miR-513b-5p相對(duì)表達(dá)量分別為0.410±0.053、1.000，CC組織miR-513b-5p表達(dá)低于癌旁組織(P<0.01)。HCT116、RKO、SW480、LoVo、SW620細(xì)胞及CCD-112CoN細(xì)胞中miR-513b-5p相對(duì)表達(dá)量分別為0.613±0.065、0.461±0.048、0.223±0.024、0.536±0.055、0.302±0.033、1.000，五種CC細(xì)胞miR-513b-5p相對(duì)表達(dá)量均低于CCD-112CoN細(xì)胞(P均<0.01)。

2.2 miR-513b-5p表達(dá)抑制對(duì)CC細(xì)胞增殖、遷移的影響 轉(zhuǎn)染0、1、2、3、4 d后，miR-513b-5p抑制劑組細(xì)胞增殖能力高于miR-con組(P均<0.05)，見表1。miR-513b-5p抑制劑組、miR-con組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(52±11)、(21±2)個(gè)，miR-513b-5p抑制劑組細(xì)胞遷移能力高于miR-con組(P<0.01)。見圖1。

表1 轉(zhuǎn)染0、1、2、3、4 d后miR-513b-5p抑制劑組、miR-con組細(xì)胞增殖能力比較

圖1 miR-513b-5p抑制劑組、miR-con組Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫染色，100×)

2.3 miR-513b-5p與STAT3的靶向關(guān)系 StarBase在線分析數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php)顯示STAT3與miR-513b-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。與miR-con組相比，miR-513b-5p模擬物組STAT3-WT細(xì)胞的熒光素酶活性降低(P<0.05)，相對(duì)熒光素酶活性分別為1.000±0.100和0.641±0.066。與miR-con組相比，miR-513b-5p模擬物組STAT3-MUT細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著改變，相對(duì)熒光素酶活性分別為1.000±0.100和1.020±0.124。miR-con組、miR-513b-5p模擬物組、miR-513b-5p抑制劑組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.100、0.310±0.034、2.510±0.311，miR-513b-5p模擬物組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于miR-con組、miR-513b-5p抑制劑組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于miR-con組(P均<0.01)。由此可見，miR-513b-5p可能靶向負(fù)調(diào)控STAT3。

2.4 STAT3過表達(dá)對(duì)CC細(xì)胞增殖、遷移的影響 轉(zhuǎn)染0、1、2、3、4 d后，miR-513b-5p模擬物組細(xì)胞增殖能力低于miR-con組，STAT3過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力高于miR-513b-5p模擬物組，組間兩兩比較，P均<0.01。見表2。miR-513b-5p模擬物組、STAT3過表達(dá)組、miR-con組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(15±3)、(34±8)、(52±11)個(gè)，miR-513b-5p模擬物組細(xì)胞遷移數(shù)量低于miR-con組，STAT3過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量高于miR-513b-5p模擬物組，組間兩兩比較，P均<0.01。見圖2。

表2 轉(zhuǎn)染后0、1、2、3、4 d miR-con組、miR-513b-5p模擬物組、STAT3過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力比較

圖2 miR-con組、miR-513b-5p模擬物組、STAT3過表達(dá)組Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫染色，100×)

3 討論

miRNA是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種基因調(diào)控元件，通過協(xié)同或抑制作用共同調(diào)控靶基因，從而參與機(jī)體各種病理生理過程[10]。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，miRNA是一類重要的調(diào)控因子，可作為多種惡性腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物[11]。例如，miR-552在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與患者不良預(yù)后密切；進(jìn)一步研究表明miR-552通過靶向張力蛋白同源的磷酸酶促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[12]。而在骨肉瘤中，miR-618通過靶向Maelstrom在體內(nèi)和體外抑制腫瘤的生長(zhǎng)[13]。miRNA表達(dá)失調(diào)預(yù)示著患者預(yù)后更差，而且miRNA在功能上與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-513b-5p在CC組織和CC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-513b-5p抑制劑可促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖、遷移能力，而miR-513b-5p模擬物可抑制HCT116細(xì)胞的增殖、遷移能力，這表明miR-513b-5p在CC中可作為抑癌基因發(fā)揮作用。

通常，miRNA可通過堿基配對(duì)方式與位于mRNA 3′UTR的互補(bǔ)序列結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，從而影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。迄今為止科學(xué)家們已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過1 400種miRNA，這些基因占人類基因組的1%～3%，而30%～60%的蛋白質(zhì)編碼基因由miRNA來調(diào)節(jié)[14]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-195-5p在CC中表達(dá)下調(diào)，并與患者生存期短密切相關(guān)；進(jìn)一步研究表明miR-195-5p通過靶向調(diào)節(jié)Yes相關(guān)蛋白1抑制CC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。類似研究報(bào)道，miR-495在CC中直接靶向FA83D蛋白抗體(FAM83D)抑制CC的生長(zhǎng)；進(jìn)一步研究表明PTEN/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路參與miR-495/FAM83D軸介導(dǎo)的CC的進(jìn)展[16]。本研究為進(jìn)一步探究miR-513b-5p的下游靶點(diǎn)，通過StarBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，STAT3是miR-513b-5p的潛在靶點(diǎn)，體外實(shí)驗(yàn)則表明miR-513b-5p可通過靶向負(fù)調(diào)控STAT3抑制CC細(xì)胞的增殖和遷移。

STAT3在CC中被頻繁激活，從而表達(dá)異常，發(fā)揮致癌作用[17]。據(jù)研究，STAT3在維持干細(xì)胞表型重要基因的表達(dá)方面起著重要作用。STAT3通路在富含腫瘤干細(xì)胞(CSC)標(biāo)記的細(xì)胞亞群中優(yōu)先激活。CD133是一種可標(biāo)記CSC的跨膜糖蛋白，而活化的STAT3可通過與NF-κB和缺氧誘導(dǎo)因子1α的聯(lián)合作用上調(diào)CD133表達(dá)，這表明STAT3可作為CSC的標(biāo)志物[18]。此外，STAT3在腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞中均被激活，激活的STAT3發(fā)生磷酸化、同型二聚化、核易位和DNA結(jié)合，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、侵襲和免疫逃逸，從而持續(xù)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[19]。因此，本研究通過熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)和Western blotting檢測(cè)證實(shí)了miR-513b-5p可直接靶向STAT3并負(fù)調(diào)節(jié)后者的表達(dá)；功能實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)STAT3可部分逆轉(zhuǎn)miR-513b-5p模擬物對(duì)CC細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-513b-5p在CC組織和細(xì)胞中低表達(dá)，miR-513b-5p表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移；miR-513b-5p可能通過靶向負(fù)調(diào)控STAT3起到抑制CC細(xì)胞增殖和遷移的作用。本研究尚存在一些不足之處，如STAT3的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和miR-513b-5p的上游靶基因不明確，需進(jìn)一步探究。此外，仍需要更大樣本的實(shí)驗(yàn)研究完善上述結(jié)論。