唐佳月 林 勇 譚淏元

結(jié)腸癌是世界上最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)生于結(jié)腸部位[1]，其發(fā)病率高，占胃腸道腫瘤的第3位[2]，一旦發(fā)生，治愈率低，復(fù)發(fā)率高，且癌細(xì)胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其病死率也較高，僅次于肺癌和肝癌，在腫瘤中居第3位[3]。至今病因尚未明確，遺傳、病史、飲食、年齡、肥胖等因素都有可能導(dǎo)致該病的發(fā)生[4]，通常男性的發(fā)病率高于女性[5]。在過(guò)去幾十年中，隨著人們生活水平的提高，結(jié)腸癌發(fā)病率也隨之上升。因此，通過(guò)新的方法治療結(jié)腸癌是十分必要的。微小RNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長(zhǎng)約21到23個(gè)核苷酸的RNA分子[6-7]，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)[8]。有研究顯示[9-10]，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其細(xì)胞凋亡增殖密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)不同的腫瘤過(guò)程，如腫瘤的形成、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。已有研究表明[11-13]，miRNA存在于結(jié)腸癌中，其中miRNA-17-92家族是miRNA的重要組成部分，同時(shí)也是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的非編碼致癌基因家族，該家族包括miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-19b、miRNA-20a和 miRNA-92a，共6個(gè)成員。目前研究表明，miRNA-19a參與多種腫瘤的形成，對(duì)多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，使其凋亡能力降低，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制信號(hào)因子抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[14-15]。本研究通過(guò)探討miRNA-19a在結(jié)腸癌中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的影響，為今后臨床上對(duì)結(jié)腸癌患者進(jìn)行診斷和治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016 年3月至2017 年3月收治的的結(jié)腸癌患者60例作為結(jié)腸癌標(biāo)本，其中結(jié)腸癌組織20例，結(jié)腸癌旁組織20例，結(jié)腸息肉組織20例。在這些患者中男性34例，女性26例，平均年齡(39.75±12.92)歲。所有患者術(shù)前皆沒(méi)有進(jìn)行針對(duì)腫瘤的治療。術(shù)中切除腫瘤后，立即取癌組織與癌旁組織標(biāo)本(距離腫瘤邊緣至少 5cm)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者的臨床資料完整；②術(shù)后病理診斷證實(shí)為結(jié)腸癌。所有患者對(duì)研究?jī)?nèi)容完全知情，均簽署知情同意書。所有樣本用液氮凍存。

1.2 材料

結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液和混合抗菌藥物(青霉素、鏈霉素)購(gòu)自Gibco公司，Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胰蛋白酶和侵襲小室購(gòu)自Sigma公司，miRNA-19a模擬物、抑制物購(gòu)自上海GenePharma公司，人工基質(zhì)膠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)研究所，CCK8 試劑盒購(gòu)自上海和元生物公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司碘化丙啶(PI) 試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，GAPDH抗體購(gòu)自Bioworld公司。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)患者結(jié)腸癌組織、結(jié)腸癌旁組織、結(jié)腸息肉組織中miRNA-19a基因的表達(dá)

所有組織標(biāo)本用液氮凍存，從中各取出50 mg，對(duì)其進(jìn)行RT-PCR分析，對(duì)其進(jìn)行提取總RNA并以總RNA的mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在擴(kuò)增儀上進(jìn)行RT-PCR。吸取懸浮細(xì)胞液，在正反向引物中各加入1 μl。miRNA-19a的引物序：上游序列：5′-CTC TGA CGT TGA ACT GAG CTT TT-3′，下游序列：5′-GCA ATC TGA AAT GCC AAA GTG-3′，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為126 bp。GAPDH的引物序：上游序列：5′-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3′，下游序列：5′-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3′，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為127 bp。將10 μl PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶吸光度[16]，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 結(jié)腸癌 LoVo 細(xì)胞體外培養(yǎng)建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

取出凍存于的LoVo細(xì)胞，在37 ℃水浴下，輕搖冷凍管，使其充分融化。融化后，放置于無(wú)菌操作臺(tái)中，吸取細(xì)胞懸浮液，加入DMEM 培養(yǎng)液，然后加入鏈霉素和青霉素各100 μg/ml及10%滅活胎牛血清，在37 ℃、5%CO2、濕度飽和條件下進(jìn)行培養(yǎng)，注意在培養(yǎng)液有變化時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液[17]。直至胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙擴(kuò)大時(shí)，加入 DMEM培養(yǎng)液。反復(fù)吹打形成單細(xì)胞懸液后，在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，倒掉上清液。重新接種在新的培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，將其鋪于6孔板中，即為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚18]。將這些細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組、轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組和空白對(duì)照組。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 脂質(zhì)體介導(dǎo) miRNA-19a轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑下轉(zhuǎn)染等量的miRNA-19a模擬物和miRNA-19a抑制物。轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組為5 μl的 miRNA-19a模擬物溶液，加入5 μl的Lipofectamine200轉(zhuǎn)染試劑和2 ml的新鮮培養(yǎng)液，充分混合后室溫下轉(zhuǎn)染20 min；轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組為5 μl的 miRNA-19a抑制物溶液，加入5 μl的Lipofectamine200轉(zhuǎn)染試劑和2 ml的新鮮培養(yǎng)液，充分混合后室溫下轉(zhuǎn)染20 min；空白對(duì)照組為2 ml的新鮮培養(yǎng)液靜置轉(zhuǎn)染20 min。轉(zhuǎn)染6～8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，且均需多次轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)1～2 d后即可檢測(cè)[19]。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 miRNA-19a基因的表達(dá)

從轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物或抑制物48 h后的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中提取總RNA，并以總RNA的miRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在擴(kuò)增儀上進(jìn)行RT-PCR，吸取2 μl的懸浮細(xì)胞液在正 反向引物中各加入1 μl。miRNA-19a引物序：上游序列：5'-GGA GTT CCT GGA CCA GTA CTT CG-3'，下游序列：5'-TTC TTG TGC TTG TGC CAT GTA-3'，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為126 bp；GAPDH引物序：上游序列5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT CAA TG-3'，下游序列：5'-AGG GGC CAT CCA CAG TCT CAA TC-3'。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為127 bp。將10 μl PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶吸光度[20]，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.7 利用 CCK8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

將各組的細(xì)胞的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞被miRNA-19a轉(zhuǎn)染后，放置于37 ℃條件下含5%CO2的培養(yǎng)箱中，分別測(cè)定3組細(xì)胞的增殖能力，然后每過(guò)12 h給予100 μl/孔的CCK8，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用紫外分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)下對(duì)各組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖活性進(jìn)行測(cè)量[21]，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值 。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.8 TUNEL法檢測(cè)miRNA-19a對(duì)細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞凋亡的影響

將各組細(xì)胞在2 000 r/min條件下離心5 min，第一次對(duì)其加入PBS洗滌2次，之后再離心除去PBS，然后加入1 ml預(yù)冷乙醇，在4 ℃的條件下放置一夜，第二天重復(fù)操作，即第二次加入含 0.3% Triton 和 50 μg/mlRNaseA的PBS洗滌2次，最后在37 ℃條件下放置30 min后離心，再加入PBS洗滌2次后便可收集。在收集好的細(xì)胞中加入700 μl的PI染液，在37 ℃避光條件下染色15 min[22]。取104個(gè)細(xì)胞用于測(cè)定結(jié)果，得出細(xì)胞增殖周期分布情況。將各組培養(yǎng)好的LoVo細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，采用多聚甲醛固定，然后加入5 μl/片的TUNEL混合液和50 μl的POD轉(zhuǎn)化劑，將各組標(biāo)本片放置于37℃條件下的濕盒中，在30 min內(nèi)用PBS沖洗3次，每次5～6 min。然后用中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，棕黃色的為凋亡細(xì)胞核，深藍(lán)色的為未凋亡細(xì)胞核[23]。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.9 細(xì)胞侵襲小室法檢測(cè)細(xì)胞的體外侵襲力

首先，構(gòu)建侵襲小室，用5×105個(gè)/ml的250 μl細(xì)胞懸液，加入鋪好基質(zhì)膠的Boyden 小室的上室，將其置于24孔板中，而下室的每個(gè)孔中需加入一定條件下的200 μl培養(yǎng)液，即建立好小室模型[24]，隨機(jī)分組，然后將其置于全培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)液中加入1000 μl10%的FBS，靜置2 h后，用胰蛋白酶消化被miRNA-19a模擬物轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞和被 miRNA-19a抑制物轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液多次洗滌，并用0.1%BSA的全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)約為2×105個(gè)/ml。將小室置于37 ℃條件下含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，1～2 d后取出小室，用工具擦除聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯( PET) 膜上表面殘留的細(xì)胞和基質(zhì)凝膠，隨即用70%甲醇浸泡 PET 膜的下表面，固定30 min，再取出用未結(jié)合型蘇木精染色10 min。染色后在在高倍光鏡下觀察，分別對(duì)miRNA-19a模擬物轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞和被 miRNA-19a抑制物轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞的侵襲力即為計(jì)算的平均值[25]。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè)患者結(jié)腸癌組織、結(jié)腸癌旁組織、結(jié)腸息肉組織中miRNA-19a基因水平比較

患者結(jié)腸癌組織中的miRNA-19a水平顯著高于結(jié)腸癌旁組織和結(jié)腸息肉組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；颊呓Y(jié)腸旁組織中的miRNA-19a水平顯著高于結(jié)腸息肉組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 患者結(jié)腸癌組織、結(jié)腸癌旁組織、結(jié)腸息肉組織中miRNA-19a基因水平比較

2.2 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中miRNA-19a基因水平比較

轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組miRNA-19a水平顯著高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組miRNA-19a水平顯著低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖 1。

表2 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中miRNA-19a基因水平比較

圖1 三組miRNA-19a基因的表達(dá)

2.3 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力比較

在各組比較中，轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力顯著高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力顯著低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力

2.4 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的周期分布和凋亡情況比較

三組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖情況在G0/G1組間相差不明顯，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在S期，轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組所占比例較其他兩組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組和空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在G2/M期，轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組所占比例較其他兩組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組和空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。且轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)在S期與G0/G1期、G2/M期比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他兩組在S期與G0/G1期、G2/M期比較差異不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力比較

轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力明顯高于轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力顯著低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

3.1 RT-PCR 檢測(cè)患者結(jié)腸癌組織、結(jié)腸癌旁組織、結(jié)腸息肉組織中miRNA-19a基因水平比較分析

患者結(jié)腸癌組織中的miRNA-19a水平顯著高于結(jié)腸癌旁組織和結(jié)腸息肉組織，且結(jié)腸旁組織中的miRNA-19a水平顯著高于結(jié)腸息肉組織。由此可知，miRNA-19a在結(jié)腸癌患者的癌組織中表達(dá)最高，結(jié)腸癌旁組織中表達(dá)次之，結(jié)腸息肉組織中表達(dá)最低。因此，可以通過(guò)比較miRNA-19a表達(dá)水平，來(lái)觀察結(jié)腸組織是否發(fā)生病變。

表4 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞數(shù)在細(xì)胞周期分布情況比較

3.2 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中miRNA-19a基因水平比較分析

轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組miRNA-19a水平顯著高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組，且轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組miRNA-19a水平顯著低于空白對(duì)照組。因此，通過(guò)檢測(cè)各組miRNA-19a基因，可以得知miRNA-19a在結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中呈現(xiàn)高水平表達(dá)。

3.3 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力比較分析

轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力顯著高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組，且轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力顯著低于空白對(duì)照組。由此可知，miRNA-19a水平與結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)關(guān)系，即miRNA-19a水平越高，結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。

3.4 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的周期分布和凋亡情況比較分析

三組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖情況在G0/G1組間差異不明顯。在S期，轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組所占比例較其他兩組顯著升高，轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組和空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。在G2/M期，轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組所占比例較其他兩組顯著升高，轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組和空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。且轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)在S期與G0/G1期、G2/M期比較差異顯著，而其他兩組在S期與G0/G1期、G2/M期比較差異不明顯。由此可知，miRNA-19a水平越高，結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞在S期細(xì)胞數(shù)增多。

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡情況得到明顯改善，細(xì)胞凋亡數(shù)量較少，凋亡率顯著低于轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組和空白對(duì)照組，而轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組。由此可知，miRNA-19a水平與結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的凋亡能力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即miRNA-19a水平越高，結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的凋亡數(shù)量越少。

3.5 各組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力比較分析

轉(zhuǎn)染miRNA-19a模擬物組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力明顯高于轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組和空白對(duì)照組，且轉(zhuǎn)染miRNA-19a抑制物組的結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力顯著低于空白對(duì)照組。由此可知miRNA-19a水平與結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力呈正相關(guān)關(guān)系，即miRNA-19a水平越高，結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的體外侵襲力越強(qiáng)。