陳祖濤 彭會麗 韓 俊 徐 揚(yáng)

右美托咪定是α2-腎上腺能受體激動劑，可選擇性高效激活中樞α2-腎上腺素受體，發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗交感以及鎮(zhèn)靜效果，已經(jīng)成為了一種常用的手術(shù)麻醉藥物和危重患者鎮(zhèn)靜藥物[1-2]。已有研究顯示右美托咪定進(jìn)入體內(nèi)能夠通過釋放miRNAs等生物活性物質(zhì)，減輕組織損傷程度，促進(jìn)受損組織的修復(fù)[3]；特別是右美托咪定對機(jī)械通氣所導(dǎo)致的大鼠肺損傷模型中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)有移植作用，從而減輕肺損傷[4-5]，但是對移植瘤的作用鮮少報(bào)道。本文具體探討了右美托咪定鞘內(nèi)注射對移植瘤大鼠行為能力的影響，以明確右美托咪定的作用效果與機(jī)制?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

TUNEL染色試劑盒購自BD公司，抗Beclin-1抗體(稀釋度1∶1000)、抗LC3抗體(稀釋度1∶2000)購自美國CST公司，TNF-α與IL-6檢測試劑盒購自上海生工公司，鹽酸右美托咪定注射液購自江蘇恒瑞公司。

18只雄性Wistar大鼠[周齡(12±1)w、體重(320±20)g、SPF級]購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，編號20914244，研究得到了實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照動物福利飼養(yǎng)動物。

1.2 移植瘤模型建立

選用胃癌細(xì)胞株MGC-803，復(fù)蘇后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期MGC-803細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108個(gè)/ml，在每只大鼠左腋下注射0.2 ml MGC-803細(xì)胞，觀察大鼠致瘤情況。建模完成以腫瘤大小≥0.1 cm2為準(zhǔn)。

1.3 大鼠麻醉方法

將所有移植瘤模大鼠分為3組：對照組、實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組，每組6只大鼠。實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，注射8%水合氯醛(350 mg/kg)，建立完整的靜脈通路，根據(jù)大鼠的生命體征及肌肉松弛狀態(tài)調(diào)整水合氯醛靜脈滴注速度。實(shí)驗(yàn)2組給予右美托咪定鞘內(nèi)注射預(yù)處理，再注射水合氯醛給予鞘內(nèi)注射右美托咪定2.5 μg/kg。實(shí)驗(yàn)1組以等劑量的生理鹽水代替。對照組不進(jìn)行腹腔麻醉，都以等劑量的生理鹽水代替。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)在給藥后1周與2周按照Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)評定大鼠的行為能力，分為0～4分，分?jǐn)?shù)越高，行為能力越好。(2)給藥后2周將所有大鼠處死，將移植瘤取出并稱重，記錄與計(jì)算大鼠的移植瘤重量和抑瘤率。(3)取大鼠的移植瘤標(biāo)本，甲醛固定后石蠟包埋，制成切片，切片厚度為4 μm，采用TUNEL法檢測與計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。(4)充分研磨大鼠的新鮮移植瘤組織，過濾，提取移植瘤中的總蛋白，采用Western bolt法檢測Beclin-1、LC3的表達(dá)情況。(5)取大鼠處死后的血液1 ml左右，靜置10 min后，3 000 rpm/min離心10 min，取上層血清，采用免疫組化法檢測TNF-α與IL-6含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為能力評分對比

給藥后1周與2周，實(shí)驗(yàn)2組的Tarlov評分都顯著高于實(shí)驗(yàn)1組與對照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)1組與對照組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠行為能力評分對比(分，

2.2 移植瘤重量和抑瘤率的比較

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組的移植瘤重量顯著降低(P<0.05)，抑瘤率顯著增加(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 細(xì)胞凋亡指數(shù)對比

實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)1組的移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(30.67±4.14)、(21.74±3.13)，都顯著高于對照組的(3.13±0.24)(t=16.267、t=14.521,P均<0.05)；3組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.842，P=0.001)。

2.4 Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)對比

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)1組移植瘤的Beclin-1、LC3相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 3組移植瘤的重量和抑瘤率的比較

表3 3組移植瘤的Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)對比

2.5 血清TNF-α與IL-6含量對比

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)1組的血清TNF-α與IL-6值顯著降低(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 3組血清TNF-α與IL-6含量對比

3 討論

當(dāng)前我國胃癌的發(fā)生率逐年增加，每年有近30萬人死于胃癌，另有約40萬新發(fā)病例。當(dāng)前胃癌的診斷和治療技術(shù)在進(jìn)步，但是很多患者在就診時(shí)仍處于晚期，預(yù)后比較差[6]。作為一種α2腎上腺素受體激動劑，右美托咪啶可選擇性高效激活α2腎上腺素能受體，具有鎮(zhèn)痛、抑制交感神經(jīng)、鎮(zhèn)靜以及抗焦慮等作用[7]。近期的研究結(jié)果顯示右美托咪啶具備抑制蛋白激酶A(PKA)的效果，進(jìn)而抑制下游蛋白磷酸化，使細(xì)胞超極化，產(chǎn)生突觸后抑制，并且可以調(diào)節(jié)致凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡[8-9]。本研究顯示給藥后1周與2周，實(shí)驗(yàn)2組的Tarlov評分都顯著高于實(shí)驗(yàn)1組與對照組，實(shí)驗(yàn)1組與對照組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)1組的移植瘤重量顯著降低，抑瘤率與細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明右美托咪啶的應(yīng)用能促進(jìn)大鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡，提高抑瘤率，從而減輕移植瘤重量，改善大鼠的行為能力。當(dāng)前也有研究顯示右美托咪啶可能在一定程度可以減輕腎缺血再灌注誘發(fā)肺損傷，對肺損傷具有一定的保護(hù)作用[10-11]。

由于各種因素的影響，當(dāng)前很多胃癌患者診斷時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期，并伴廣泛浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中自噬機(jī)制失調(diào)是胃癌轉(zhuǎn)移的初始階段，也是決定胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[12]。自噬發(fā)生于真核細(xì)胞內(nèi)，為2型程序性死，其發(fā)生過程依賴溶酶體，可高效地降解細(xì)胞，是決定腫瘤細(xì)胞預(yù)后的關(guān)鍵因素[13]。Beclin-1、LC3等的表達(dá)與自噬密切相關(guān)，胃癌患者體內(nèi)的Beclin-1基因表達(dá)降低，Beclin-1基因缺失和胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，Beclin-1基因表達(dá)降低可降低腫瘤細(xì)胞自噬水平。LC3蛋白是通用的細(xì)胞自噬膜標(biāo)志物，可定位于自噬泡膜和前自噬泡膜表面，細(xì)胞合成的LC3蛋白經(jīng)過修飾成為LC3-Ⅱ，細(xì)胞自噬活性與LC3-Ⅱ的含量成正比，檢測LC3-Ⅱ的含量可間接反映腫瘤細(xì)胞的自噬能力[14-15]。本研究顯示實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)1組的移植瘤Beclin-1、LC3相對表達(dá)量都顯著高于對照組，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明右美托咪啶的應(yīng)用能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬，進(jìn)而抑制腫瘤生長，主要在于右美托咪定能減少血循環(huán)和組織中兒茶酚胺的釋放，降低交感神經(jīng)的興奮性，抑制應(yīng)激反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬[16-17]。

右美托咪定除了鎮(zhèn)靜、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)作用，還具有抗炎作用，能抑制機(jī)體的無菌性炎癥，防止組織器官進(jìn)一步被損害[18-19]。本研究顯示與對照組相比，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)1組的血清TNF-α與IL-6值顯著降低，實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組對比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也表明右美托咪啶的應(yīng)用的能抑制TNF-α與IL-6的表達(dá)。本研究也有一定的不足，右美托咪啶的作用通路比較復(fù)雜，對移植瘤的影響機(jī)制還不明確，可能存在研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。

綜上所述，右美托咪定鞘內(nèi)注射對胃癌移植瘤大鼠中的應(yīng)用能抑制TNF-α與IL-6的表達(dá)，也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡與自噬，從而提高抑瘤率與減輕移植瘤重量，改善大鼠的行為能力。