房曉雪，徐 偉，周婷婷，唐 燕，王春馳，姜瑞芝，邱智東，羅浩銘

(1.長春中醫(yī)藥大學藥學院中藥藥劑實驗室，吉林 長春130117；2.長春中醫(yī)藥大學藥學院藥物化學與中藥化學教研室，吉林 長春130117；3.吉林省吉測檢測技術(shù)有限公司研發(fā)部，吉林 長春130117)

天然產(chǎn)物中糖復(fù)合物如糖蛋白、核酸和多糖類成分均具有多樣的生物活性，在生理病理過程如免疫識別、組織修復(fù)和細胞功能等方面均扮演重要角色[1-4]。人參為五加科多年生草本植物，具有補氣固脫、健脾補肺和開心益智等作用[5-7]。前期動物實驗[8-12]證實：人參活性糖肽(panax ginseng active glycopeptide, PGG)可改善老年癡呆模型小鼠的學習記憶功能，并具有鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜催眠的功效。研究[13-16]表明：PGG可明顯抑制β淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導的細胞凋亡活性，具有潛在的神經(jīng)保護作用。本研究分析PGG在動物體內(nèi)的分布，確定其是否以腦組織為靶點。由于此類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且缺少發(fā)光基團，難以進行體內(nèi)示蹤，阻礙了對PGG作用機制的進一步研究。目前，常采用酶、金屬離子、同位素和熒光素等物質(zhì)對糖復(fù)合物進行標記，以便對其組織內(nèi)分布及代謝過程進行監(jiān)測[17-19]。異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC)是一種在細胞生物學、免疫學和藥物研究領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛的熒光素衍生物，其主要與被標記物中的伯胺基團反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)熒光標記，因此常被用來標記蛋白質(zhì)、抗體和核酸分子等[20-22]。PGG結(jié)構(gòu)中除肽鏈N端的伯胺之外，帶有伯胺基團的賴氨酸質(zhì)量分數(shù)為2.15%(與總蛋白比較)，為進行FITC標記提供了理論可能。此外，PGG較大的相對分子質(zhì)量和極性限制了其通過血腦屏障(blood brain barrier, BBB)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(center nervous system, CNS)發(fā)揮藥效的能力。在PAN等[23]證明促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)等肽類物質(zhì)可完整穿越BBB之前，學術(shù)界普遍認為肽類等大分子難以穿越BBB。隨著研究技術(shù)的不斷深入，越來越多的大分子，如神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3，NT-3)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、IgG、白蛋白和P-糖蛋白等已被證明可透過BBB到達CNS發(fā)揮藥效作用[24-25]，因此PGG具有通過BBB的潛力。目前關(guān)于PGG在小鼠不同組織中的分布情況及其靶向趨勢的研究較少。本研究利用FITC對PGG進行標記，并利用熒光分光光度法測定小鼠體內(nèi)藥物的組織分布和靶向效率，探討PGG通過BBB到達CNS發(fā)揮藥效的依據(jù)，以期為今后研究人參糖肽類成分通過BBB的轉(zhuǎn)運機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

昆明種小鼠78只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。PGG由本課題組自制[5-12]。FITC(山東西亞化學股份有限公司)，苯酚、碳酸鈉和硫酸(北京化工廠)。透析袋(上海源葉公司)，MS105DU型電子分析天平(吉林省計量科學研究院)，UV-5100型紫外可見分光光度計、IRAffinity-1S型傅里葉紅外光譜儀和F-2700型熒光分光光度計(日本島津公司)，WH-2型渦旋混勻器(上海滬西分析儀器廠有限公司)，78-1型磁力加熱攪拌器(金壇市江南儀器廠)，R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申須生物科技有限公司)，H/T16MM型臺氏高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2 PGG的標記和純化

稱取200 mg PGG，溶于10 mL蒸餾水中，采用0.5 mol·L-1碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至8.5，加入25 mg FITC室溫下避光反應(yīng)過夜，將反應(yīng)物用0.1 kD的透析袋透析24 h。透析內(nèi)液上Sephadex G-75柱純化，蒸餾水洗脫，流速1 mL·min-1，每管 5 mL，共80管，分別于波長280 nm處檢測肽類吸光度(A)值，苯酚-硫酸法反應(yīng)后于波長490 nm處檢測糖類A值，以A值為縱坐標，管數(shù)為橫坐標，繪制折線圖。根據(jù)洗脫圖形，收集相應(yīng)洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到PGG-FITC，避光保存。

1.3 紫外光譜掃描

分別稱取PGG、PGG-FITC、FITC 1.5 mg，加入PBS緩沖液，配制成質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1的溶液，在波長200～800 nm內(nèi)進行紫外光譜掃描。

1.4 紅外光譜掃描

分別稱取PGG 1.085 mg、PGG-FITC 1.1 mg、FITC 0.015 mg和干燥的溴化鉀450 mg(按照PGG的熒光取代度為1.435%計算)，在瑪瑙研缽中研磨、混勻，取適量的混合品放入壓片模具中，在約12 MPa的壓力下2 min后，樣品被壓成半透明的薄片。將上述樣品置于紅外光譜儀中，在波數(shù)4 000～400 cm-1內(nèi)進行紅外光譜測定(掃描樣品前需先壓1個溴化鉀空白片扣除水和CO2的干擾)。

1.5 熒光取代度測定[26]

精密移取質(zhì)量濃度為0.122 0 mg·L-1的FITC溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分別加入7支錫箔紙包裹的刻度試管中，再加入PBS緩沖液定容至10 mL。以PBS緩沖液為空白對照，依次測定各管的熒光強度。以 FITC 的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、熒光強度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，并計算回歸方程。將PGG-FITC樣品配制成質(zhì)量濃度為1.020 1和2.550 3 mg·L-1的PBS緩沖液，測定其熒光強度，代入回歸方程，計算PGG-FITC的熒光取代度。

1.6 方法學驗證(以心臟組織中PGG-FITC的定量分析方法為例)

1.6.1 對照品溶液的配制 精密稱取FITC樣品6.01 mg，加入PBS緩沖液，配制成2.404 mg·L-1的對照品溶液。

1.6.2 標準曲線的繪制 精密移取空白組小鼠心臟勻漿液200 μL，分別加入“1.6.1”中對照品溶液0、1、5、20、60、80和100 μL，再加入PBS緩沖液2.5 mL，以0 μL為空白對照，測定熒光強度。分別以勻漿液中FITC質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、熒光強度為縱坐標(Y)繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.6.3 精密度實驗 精密移取空白組小鼠心臟勻漿液200 μL，再精密移取“1.6.1”中對照品溶液，配制成低、中和高質(zhì)量濃度(0.000 89、 0.052 17和0.126 32 mg·L-1)FITC溶液。1 d內(nèi)連續(xù)測定6次熒光強度，計算精密度和相對標準方差(relative standard deviation, RSD)，RSD值越小，準確度越高。

1.6.4 回收率實驗 取“1.6.3”中制備的低、中和高質(zhì)量濃度FITC溶液，測定熒光強度，計算回收率和RSD值。

1.6.5 穩(wěn)定性實驗 取“1.6.3”中制備的低、中和高質(zhì)量濃度FITC溶液，-4 ℃放置24 h，分別于2、4、6、8、12和24 h測定熒光強度，綜合評價該方法穩(wěn)定性。

1.7 PGG在小鼠不同組織中的分布

78只小鼠隨機分為13組，每組6只，其中6組小鼠按照355 mg·kg-1劑量尾靜脈注射PGG-FITC(PGG-FITC組)，6組小鼠按照5.09 mg·kg-1劑量尾靜脈注射FITC(FITC組)，1組小鼠尾靜脈注射PBS緩沖液作為空白對照組。給藥后分別于0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和24.0 h頸椎脫臼處死小鼠并解剖，采集各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、腸和胃組織。采用PBS緩沖液洗凈，濾紙吸干，精密稱質(zhì)量，加入9倍體積PBS緩沖液，研磨，收集組織勻漿液，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液200 μL，加入PBS緩沖液2.5 mL，混勻，采用熒光分光光度計在發(fā)射波長494 nm、激發(fā)波長515 nm 條件下測定熒光強度。 利用“1.6”中的回歸方程計算小鼠主要臟器組織中PGG-FITC和FITC水平。根據(jù)小鼠主要臟器組織中PGG-FITC和FITC水平繪制藥物濃度-時間曲線，采用梯形法計算藥時曲線下面積(AUC)值，并以AUC總和為參比，計算小鼠主要臟器組織中的靶向效率(Te)值，Te=AUC/∑AUC×100%。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 PGG-FITC的純化和收率

為除去游離FITC，將反應(yīng)產(chǎn)物通過24 h透析，透析內(nèi)液經(jīng)Sephadex G-75進一步純化，利用苯酚-硫酸法(490 nm)和紫外測定法(280 nm)分別間管檢測A值，以管數(shù)為橫坐標(X)、A值為縱坐標(Y)繪制折線圖，多糖和蛋白洗脫峰重合，按照洗脫圖收集30～60管洗脫液，濃縮，凍干，得到PGG-FITC 60 mg，收率為27%。見圖1。

圖1 Sephadex G-75洗脫曲線圖

2.2 紫外光譜分析

PGG在200～800 nm區(qū)間無明顯吸收峰，F(xiàn)ITC在280 和490 nm處有明顯吸收峰，PGG-FITC在280和490 nm處有吸收峰出現(xiàn)，說明實現(xiàn)了FITC對PGG的熒光標記。見圖2(插頁一)。

2.3 紅外光譜分析

PGG在3 600、2 900和1 600 cm-1附近出現(xiàn)明顯糖類物質(zhì)專屬吸收峰，F(xiàn)ITC在2 050、1 541、1 508、1 454、1 117和849 cm-1處出現(xiàn)明顯專屬吸收峰。 PGG-FITC在1 600～1 400 cm-1區(qū)間的吸收峰明顯增強，1 117和849 cm-1處出現(xiàn)明顯特征峰，進一步驗證了FITC對PGG的熒光標記。見圖3(插頁一)。

2.4 熒光取代度

以FITC作為標準品，相關(guān)性分析結(jié)果顯示：FITC質(zhì)量濃度與熒光強度存在相關(guān)性(P<0.05)，其標準曲線回歸方程為：Y=22 460X+29.479 (r=0.999 7)，線性范圍2.44×10-3～1.71×10-2mg·L-1，檢測質(zhì)量濃度為1.020 1和2.550 3 mg·L-1PGG-FITC溶液的熒光強度分別為329.6和922.9，計算PGG-FITC的熒光取代度為1.435%。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關(guān)系 以FITC作為對照品，相關(guān)性分析結(jié)果顯示:FITC質(zhì)量濃度與熒光強度存在相關(guān)性(P<0.05)，分別以組織勻漿液中FITC的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、測定的熒光強度為縱坐標(Y)繪制標準曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)結(jié)果見表1，均滿足生物樣品測定要求。

表1 FITC在小鼠主要臟器組織中的線性回歸方程

2.5.2 精密度 按“1.6.3”中的方法測定低、中和高質(zhì)量濃度各樣品的熒光強度，精密度RSD值均小于8%，均滿足生物樣品測定要求。

2.5.3 回收率 按“1.6.4”中的方法測定低、中和高質(zhì)量濃度各樣品的熒光強度，回收率為90.12%～110.89%，RSD值均小于11%，均滿足生物樣品測定要求。

2.5.4 穩(wěn)定性 按“1.6.5”中的方法測定低、中、高質(zhì)量濃度各樣品的熒光強度，其穩(wěn)定性良好，RSD值均小于10%，均滿足生物樣品測定要求。

2.6 FITC和PGG-FITC在小鼠主要臟器組織中的分布

FITC組小鼠主要臟器組織中藥物水平從高到低依次為肝、腦、胃、腎、腸、心、脾和肺組織，PGG-FITC組小鼠主要臟器組織中藥物水平從高到低依次為腦、心、肝、腎、脾、胃、肺和腸組織。與FITC組比較，PGG-FITC組小鼠主要臟器組織中藥物水平均明顯升高(P<0.01)，且腦組織中的藥物水平升高更為明顯。比較小鼠主要臟器組織中PGG-FITC和FITC的Te值，腦組織中PGG-FITC的Te值最高(53%)，說明PGG具有腦靶向趨勢。見表2。

表2 FITC組和PGG-FITC組小鼠主要臟器組織中藥物的AUC及Te

3 討 論

本研究通過PGG與FITC發(fā)生親核反應(yīng)生成PGG-FITC，利用紫外分光光度法和紅外分光光度法對標記產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)分析。在紫外光譜圖中，PGG在200～800 nm區(qū)間無吸收峰，而標記后產(chǎn)物PGG-FITC在280 和490 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰，且2個吸收峰與FITC吸收峰基本重合，說明實現(xiàn)了FITC對PGG的熒光標記。在紅外光譜圖中，PGG在3 600、2 900和1 600 cm-1附近出現(xiàn)糖類物質(zhì)吸收峰，表明PGG為糖類化合物。FITC在特征區(qū)的吸收峰以及歸屬：2 050 cm-1為S=C=N-吸收峰，1 541、1 508和1 454 cm-1為苯環(huán)中C=C骨架吸收峰，1 117 cm-1為C-O-C吸收峰，849 cm-1為苯環(huán)中C-H吸收峰；而標記后產(chǎn)物PGG-FITC的紅外光譜圖2 050 cm-1處未出現(xiàn)吸收峰，這是由于PGG中伯胺與FITC結(jié)構(gòu)中S=C=N-基團反應(yīng)生成-NH-(S=C)-NH-基團所引起，同時在1 600～1 400 cm-1區(qū)間及1 117和849 cm-1處吸收峰都明顯增強，這些特征峰均來自FITC結(jié)構(gòu)中C=C、C-O-C和C-H基團，進一步證明實現(xiàn)了FITC對PGG的熒光標記。同時，紅外分光光度法檢測結(jié)果也說明反應(yīng)產(chǎn)物通過透析、Sephadex G-75兩步純化可完全排除PGG-FITC中的游離FITC。以上2種鑒別方法均證明：PGG與FITC通過共價鍵相連，實現(xiàn)了FITC對PGG的熒光標記，其熒光取代度為1.435%。該方法操作簡單，價格低廉。此外本研究使用熒光分光光度法建立了小鼠不同組織中PGG-FITC和FITC的定量分析方法，經(jīng)方法學驗證，該研究方法準確可靠。

近年來研究[27-28]顯示：不僅脂溶性較高、相對分子質(zhì)量較小的藥物易透過BBB到達CNS發(fā)揮作用，相對分子質(zhì)量較大的化合物也可以通過不同的轉(zhuǎn)移機制透過BBB發(fā)揮藥效，如多肽或蛋白等大分子物質(zhì)可以通過吸附介導轉(zhuǎn)運、受體介導轉(zhuǎn)運或載體介導轉(zhuǎn)運等途徑實現(xiàn)跨BBB轉(zhuǎn)運，從而可以使大分子藥物透過BBB 到達CNS。隨著研究的不斷深入，越來越多的實驗數(shù)據(jù)證明：氫鍵鍵能對多肽或蛋白等大分子物質(zhì)透過BBB也具有一定的影響，此外大分子藥物還可以通過胞吞、胞吐作用透過BBB 到達CNS發(fā)揮作用。本實驗通過小鼠尾靜脈分別注射PGG-FITC和FITC，采用熒光分光光度法測定小鼠不同組織中藥物水平，并計算藥時AUC和Te值，結(jié)果顯示：PGG具有明顯的腦靶向趨勢，說明腦組織對PGG有較強的攝取能力，證明PGG可以通過某些轉(zhuǎn)移機制透過BBB到達CNS發(fā)揮藥效。本研究結(jié)果可進一步證明本課題組前期藥效學實驗結(jié)果的正確性和可靠性，同時也為今后研究人參糖肽類成分通過BBB的轉(zhuǎn)運機制奠定了基礎(chǔ)。