黃江勇，李嬋秀，鄭志超, 王洪娟，郭呂華，吳 哲，羅 濤

(1. 廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院修復科·廣州口腔病研究所·口腔醫(yī)學重點實驗室，廣東 廣州 510140；2.中山大學附屬第三醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510000;3.廣東省深圳海一時代基因科技有限公司，廣東 深圳 518000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一種雌激素缺乏引起的失衡性骨代謝疾病，因凈骨吸收大于骨生成導致軀干骨的骨折，嚴重影響了中老年女性的生活質(zhì)量[1]?？谇活M面骨流失近年來也被臨床和動物實驗研究[2-3]所證實，且PMO并發(fā)牙周炎患者牙槽骨吸收更為嚴重[3]。傳統(tǒng)觀念認為雌激素缺乏導致鈣吸收和代謝障礙是PMO的主要發(fā)病機制，然而炎癥性疾病、自身免疫疾病與骨質(zhì)疏松在涉及骨病損時表現(xiàn)出類似的疾病特征，提示免疫防御參與了骨疾病發(fā)展且起到樞紐作用[4-5]。T細胞為特異性免疫應答中的一類淋巴細胞，可通過調(diào)控造血干細胞歸巢及成骨細胞分化、分泌白細胞介素類的炎癥因子，結合受體表達骨調(diào)控相關基因WNT10B和核因子κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)等多種方式參與調(diào)控成骨與破骨平衡[6]。

輔助性T 細胞17(T helper cell 17, Th17)亞群是最近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，在細胞介導的組織反應中起重要作用，研究[7]證實：Th17在多種自身免疫性疾病(類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和哮喘等)中起重要作用。牙周病是一種牙周支持組織的感染性疾病。2009年研究人員首次在牙周炎患者牙齦中檢測到Th17細胞[8]。炎性狀態(tài)下Th17細胞和負調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)的動態(tài)平衡向Th17細胞方向移動，參與牙周病損的發(fā)生[9]。白細胞介素17(interleukin-17, IL-17)是Th17細胞分泌的抗外源性微生物的重要炎性因子，在牙周炎患者牙周組織中高表達[8]，然而IL-17在健康牙周組織中的表達及其與雌激素缺乏的關系尚不明確。

益生菌的攝入有助于改善免疫系統(tǒng)推動了益生菌奶制品及飲品的普及，盡管這一觀念缺乏可靠的臨床數(shù)據(jù)，但最近糞便微生物移植的研究再次將益生菌帶入科學前沿[10]。小范圍的臨床研究證實益生菌對骨質(zhì)疏松也具有治療作用[11]，動物實驗提示益生菌可抑制腸炎導致的IL-17表達水平升高[12]。外周血IL-17和RANKL水平與骨礦化密度有密切關聯(lián)[13]，益生菌是否對牙周IL-17具有調(diào)節(jié)作用是本研究要解決的問題。本研究采用卵巢摘除致雌激素缺乏小鼠模型，探討雌激素缺乏及益生菌干預對小鼠牙齦及骨髓組織中炎性因子IL-17表達的影響，闡明雌激素缺乏與牙周炎關聯(lián)性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器8周齡SPF級健康C57BL/6J雌性小鼠，體質(zhì)量16.5～17.5 g，購買于廣東省醫(yī)學動物實驗中心，動物使用許可證號：SCXK(粵)2013-0003。PBS、DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、青/鏈雙抗和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，中性甲醛(中國博士德公司)，含鼠李乳糖桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)的Culturelle Pro-well益生菌(美國iHealth公司)，紅細胞裂解液和PMA/Ionomycin(美國Thermofisher公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYSB Prime Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)，F(xiàn)ITC標記抗小鼠T細胞抗原受體β(T cell receptor β,TCRβ)、PerCP標記抗小鼠CD4和PE標記抗小鼠IL-17(美國Biolegend公司)。雙能X線骨密度儀(美國GE公司)，流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，ABI 7300型實時定量qPCR儀 (美國Applied Biosystems公司)。

1.2 實驗動物分組和動物模型制備15只小鼠飼養(yǎng)于23℃～25℃和40%～60%相對濕度環(huán)境中，自由飲食適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組、卵巢摘除組和益生菌干預組，每組5只。假手術組小鼠行雙側背部手術切口后直接縫合；卵巢摘除組小鼠行雙側卵巢摘除手術；益生菌干預組小鼠行雙側卵巢摘除手術，術后第2天起，每日灌服益生菌1次(0.5 mL)；2周后處死小鼠。LGG的灌服量依照人與動物的劑量換算，計算小鼠的等效劑量。嬰兒服用LGG量為每天1 500 mg，小鼠的等效劑量=1 500 mg·15 kg-1= 100 mg·kg-1，按照小鼠體質(zhì)量計算，每只小鼠每天需要 2 mg。將含LGG的益生菌1 000 mg稀釋至20 mL PBS載體溶液中，充分溶解后，使用1 mL注射器每只每天灌服0.5 mL，實驗重復3次。本實驗通過廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會倫理審查，嚴格按照動物使用和關懷指導的原則進行相關實驗步驟。

1.3 小鼠骨礦物質(zhì)密度 (bone mineral density, BMD) 檢測麻醉后處死小鼠，獲取小鼠左側股骨，股骨標本沿長軸固定于掃描臺上進行掃描，采用圖像分析軟件計算獲得總體BMD，對比模型建立時及處死時BMD的變化。ΔBMD=BMD2周-BMD初始，BMD變化百分率=ΔBMD/BMD初始×100%。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測小鼠骨髓細胞和牙齦組織中IL-17 mRNA表達水平小鼠骨髓細胞離心后提取總RNA，檢測IL-17 mRNA基因的表達。另取小鼠下牙頜第一磨牙牙齦組織，按照 TRIzol 試劑盒說明書提取總RNA。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。IL-17引物序列：上游引物 5′-TTGGAGGCAGACACCCACC-3′，下游引物 5′-GATAGCGGTCCTCATCCGTG-3。取1 μg RNA樣本, 按照Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作得到模板cDNA, 以cDNA為模板擴增。反應條件： 95℃、10 min; 95℃、15 s， 58℃、30 s， 72℃、30 s，循環(huán)35次。采用2-ΔΔCt法計算IL-17 mRNA表達水平。

1.5 流式細胞術檢測小鼠骨髓中Th17細胞占CD4+TCRβ+細胞百分率取小鼠右側股骨，剔除附著肌肉組織暴露股骨和脛骨，將分離的骨組織置于盛有DEME的培養(yǎng)皿中，無菌眼科剪斷長骨，暴露骨髓腔，用1 mL無菌注射器抽取含10%血清的DEME培養(yǎng)液反復從骨髓腔一端沖洗至另一端，直至骨髓腔發(fā)白，吸管反復吹打沖出之骨髓組織培養(yǎng)液，加入紅細胞裂解液裂解后反復漂洗，獲得骨髓細胞，取3/4細胞進行流式細胞術檢測。將細胞離心放入96孔板，用含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基重懸單個核細胞，使細胞濃度為1×107mL-1，使用含有PMA/Ionomycin的活化培養(yǎng)基刺激4 h，每隔1～2 h 取出震蕩混勻。所得到的上述細胞用含1% BAS的預冷PBS洗滌2次，300 g離心5 min，分別加入含有100 μL CD4、TCRβ和 IL-17的抗體，室溫避光放置30 min進行染色，每管加入2 mL預冷1倍流式細胞染色液漂洗，300 g離心5 min后棄上清，洗滌并重懸細胞，通過流式細胞儀測定Th17細胞數(shù)量，計算小鼠骨髓中Th17細胞占CD4+TCRβ+細胞的百分率。

2 結 果

2.1 各組小鼠BMD及其變化百分率與假手術組比較，術后2周卵巢摘除組小鼠BMD及其變化百分率明顯降低(P<0.05)，益生菌干預組小鼠BMD及其變化百分率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與卵巢摘除組比較，益生菌干預組小鼠BMD及其變化百分率明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠骨髓細胞和牙齦組織中IL-17 mRNA表達水平與假手術組比較，卵巢摘除組小鼠骨髓細胞和牙齦組織中IL-17 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。與卵巢摘除組比較，益生菌干預組小鼠骨髓細胞和牙齦組織中IL-17 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，且與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組小鼠股骨BMD及其變化百分率

表2 各組小鼠骨髓細胞和牙齦組織中IL-17 mRNA表達水平

2.3 各組小鼠骨髓中Th17細胞占CD4+TCRβ+細胞百分率與假手術組比較，卵巢摘除組小鼠骨髓中Th17細胞占CD4+TCRβ+細胞百分率明顯升高(P<0.05)；與卵巢摘除組比較，益生菌干預組小鼠骨髓中Th17細胞占CD4+TCRβ+細胞百分率明顯降低(P<0.01)，但與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

1:Sham operation group;2:Ovariectomy group;3:Probiotics group.*P<0.05 vs sham operation group; △P<0.05 vs ovariectomy group.

3 討 論

IL-17是一種強大的炎性因子及炎癥反應調(diào)節(jié)因子，其受體存在于多種細胞(成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞)中，除了通過誘導細胞RANKL的表達直接介導破骨細胞生成外，IL-17還能刺激單核細胞和成纖維細胞等分泌前列腺素E及粒細胞集落刺激因子促進淋巴細胞增殖分化放大炎癥，在自身免疫中起重要作用[14]。在牙周炎癥中IL-17可通過刺激核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在內(nèi)皮細胞、成纖維細胞中的轉(zhuǎn)錄，誘導T細胞增殖起到放大炎癥的作用[15]。然而IL-17在牙周疾病中主要起保護作用還是破壞作用尚有爭議，盡管多項研究[8,16-18]顯示：IL-17促進破骨細胞增殖和分化，且IL-17水平與骨吸收有密切關聯(lián)，然而IL-17受體敲除小鼠的牙周易感性增加，牙周病病損更嚴重，且雌性小鼠更易感，提示IL-17 在牙周炎中的保護作用和促進作用的矛盾關系。研究[19]顯示：IL-17在牙周粒細胞招募中不可或缺，對抵抗病源菌對牙槽骨的損害起著關鍵作用。 本研究結果顯示：卵巢摘除致雌激素缺乏小鼠牙齦組織中IL-17表達水平上調(diào)，骨髓中Th17細胞在CD4+TCRβ+細胞中的百分率升高，與骨質(zhì)疏松存在關聯(lián)性。

菌群與人體健康之間的關系日益得到重視，菌群在正常生理活動及疾病中均扮演重要角色。除了影響人體腸內(nèi)分泌細胞、腸道通透性及免疫系統(tǒng)的功能，調(diào)節(jié)宿主能量的吸收及代謝，腸道菌群還是人體免疫功能的重要部分[20-21]。腸道T細胞占所有淋巴器官中T細胞比例高達50%，腸道是除了胸腺外T細胞激活的主要場所。研究[22-24]顯示：無細菌環(huán)境下的小鼠骨密度高于正常小鼠，將其放入有菌環(huán)境其骨密度會回到正常范圍，猜測與腸道中的特定菌群特異性誘導Th17細胞分化有關，而骨質(zhì)疏松引起的腸道通透性增加可使小鼠腸道菌群發(fā)生變化。菌群異常可導致骨密度異常，為研究益生菌是否具有增加骨密度的作用，有研究者通過對低鈣飼料飼養(yǎng)的大鼠喂食高產(chǎn)維生素K7的益生菌，發(fā)現(xiàn)其可預防鈣攝入不足引起的骨質(zhì)疏松[25]。本研究結果顯示：灌服含LGG益生菌，可阻止小鼠因雌激素缺乏導致的骨質(zhì)疏松，并降低小鼠牙齦組織中IL-17的表達，提示益生菌在牙周疾患中具有預防作用；同時由于益生菌這一作用，通過降低骨髓CD4+TCRβ+細胞中Th17細胞的比例，降低骨髓中炎癥因子IL-17 mRNA表達，表明牙齦組織中的IL-17可能為部分骨髓Th17細胞通過外周循環(huán)游走到牙齦。隨機雙盲臨床對照試驗[26]提示：益生菌可能改善牙周炎所致附著喪失，與本研究結果益生菌降低雌激素分泌不足小鼠牙齦組織中IL-17的表達這一現(xiàn)象，共同提示其對牙周炎的治療作用可能是通過降低牙周組織中IL-17表達而實現(xiàn)的。

自身免疫疾病中女性發(fā)病率明顯高于男性這一現(xiàn)象，引發(fā)了大量雌激素相關的實驗研究。雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)存在于人體大多數(shù)細胞(成骨細胞、破骨細胞及免疫細胞)中，雌激素通過與ERα結合，直接激活基因啟動子中的雌激素反應元件，或作為輔因子與其他轉(zhuǎn)錄因子激活反應原件如NF-κB/AP1的間接激活作用，發(fā)揮生物學效應。傳統(tǒng)理論[27]認為：雌激素通過與成骨和破骨細胞相應受體結合，促進成骨細胞分化和破骨細胞凋亡，抑制RANKL表達，調(diào)控骨平衡。T細胞表面受體敲除實驗結果[28]顯示：T細胞與自身免疫性疾病關系密切。T細胞表面ERα與雌激素結合后，通過白細胞介素的表達、細胞因子受體的表達和效應T細胞的激活發(fā)揮調(diào)控作用[29]。T細胞除了通過分泌RANKL參與骨關節(jié)炎的疾病發(fā)展外，還可通過Th1細胞分泌的γ-干擾素(interferon γ，IFN-γ)及Th17細胞分泌的IL-17參與牙周炎的進展[30]。卵巢摘除的T細胞缺陷裸鼠不會發(fā)生骨質(zhì)疏松[31]，Th17細胞敲除的小鼠能免受炎癥引起的牙周骨吸收[32]，提示Th17細胞可能在牙周炎癥及骨質(zhì)疏松中起重要作用。由于在本研究中，雌激素缺乏導致小鼠股骨骨髓細胞中Th17細胞的比例上升，推斷益生菌干預通過降低了Th17細胞的比例及IL-17的表達水平預防了骨質(zhì)疏松的發(fā)生，IL-17水平升高可能參與了軀干骨骨密度的降低及牙周骨密度的降低(本研究中由于頜骨無炎癥刺激，僅觀察了IL-17基因的表達)。在牙周致病菌的局部因素作用下，IL-17放大免疫反應并介導破骨反應，是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女發(fā)生牙周炎的可能機制，益生菌干預配合牙周治療對雌激素缺乏導致的牙周炎有預防作用。

綜上所述，通過益生菌干預處理卵巢摘除致雌激素缺乏小鼠，可阻止因雌激素缺乏導致的小鼠牙齦組織和骨髓細胞中IL-17基因上調(diào)及骨髓細胞Th17細胞的比例，起到預防因雌激素缺乏所致牙周炎的作用。本研究為雌激素缺乏導致的骨質(zhì)疏松與牙周炎關聯(lián)性研究提供了理論依據(jù)，但其具體機制尚需進一步研究。