王 景，葛 靜，王 旭，房桂英，代麗麗，劉 晶

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050030)

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，近年來宮頸癌的發(fā)病趨向于年輕化，嚴(yán)重影響女性健康。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲容易引起機(jī)體多器官功能衰竭和血管破裂，發(fā)生失血性休克，死亡率極高。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，涉及到體內(nèi)多種物質(zhì)和基因的參與，其中外泌體作為一種細(xì)胞外囊泡，是微環(huán)境中細(xì)胞間通訊的重要載體[1-2]。在腫瘤進(jìn)展過程中，癌細(xì)胞通過外泌體與內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[3]。小檗堿又名黃連素，從黃連和黃柏等中草藥中提取獲得，是一種常見的異喹啉類生物堿，具有抗病原微生物的功效。研究[4-7]顯示：鹽酸小檗堿可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等方式，發(fā)揮其對(duì)肺癌、胃癌、鼻咽癌和肝癌等不同腫瘤細(xì)胞的預(yù)防及治療作用。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見鹽酸小檗堿在抑制宮頸癌細(xì)胞外泌體分泌方面的相關(guān)研究報(bào)道。本研究主要通過觀察鹽酸小檗堿對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞釋放外泌體的干預(yù)作用及其對(duì)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。鹽酸小檗堿片(規(guī)格0.1 g/片)，華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H42021425。蛋白質(zhì)定量試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，培養(yǎng)基購自?？苽惞?，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自加拿大Stemcell公司，噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自索德國(guó)萊寶公司，兔抗人CD63 單克隆抗體、兔抗人CD81單克隆抗體和兔抗人 β-actin單克隆抗體均購自英國(guó)Abcam公司，兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase, Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)單克隆抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。Transwell小室購自美國(guó)Millipore公司，TGL-16MS型高臺(tái)式速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，DYY-12型多功能電泳儀 (北京六一生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將FBS于4℃、100 000 g離心70 min，棄去沉淀，得到無外泌體的FBS。將宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，待生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 外泌體蛋白提取和定量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，采用含10% FBS的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107mL-1，分為對(duì)照組和低、中、高劑量鹽酸小檗堿組，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別采用含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，800 r·min-1離心5 min，收集HeLa細(xì)胞，用胰酶消化，參照文獻(xiàn)[8]采用超速離心法提取外泌體，500 g離心10 min，取上清液，12 000 g離心20 min，經(jīng)220 nm濾膜過濾，10 000 g超速離心90 min，去上清液，得到沉淀即為外泌體。加入裂解液裂解30 min后，4℃、12 000 g離心20 min，得到上清液為外泌體蛋白，按照Bio-Rad DC蛋白試劑盒說明書檢測(cè)外泌體蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳2 h，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入兔抗人CD81抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人CD63抗體(1 ∶1 000稀釋)，PBS洗滌，加入二抗，孵育1 h，PBS洗滌，ECL法顯色，采用Quanitity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，胰酶消化，用含有10% FBS的培養(yǎng)基配制成細(xì)胞密度為1×105mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，37℃、5% CO2孵育過夜，貼壁后，棄去培養(yǎng)液，分為對(duì)照組和低、中、高劑量鹽酸小檗堿組，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別加入含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)6復(fù)孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24和48 h后，棄去培養(yǎng)液，于各孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·L-1)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO，置于搖床室溫避光振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 =(對(duì)照組A值-鹽酸小檗堿組A值)/對(duì)照組A值 × 100%。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，加入6孔板中，于37℃孵育過夜，用移液槍頭垂直劃痕。PBS沖洗，去除劃下的細(xì)胞，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別加入含10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的無血清培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含藥物的無血清培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0和24 h時(shí)拍照，每孔設(shè)3個(gè)平行樣，計(jì)算細(xì)胞遷移率，以細(xì)胞遷移率代表細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞遷移率 =24 h刮痕寬度/0 h刮痕寬度×100%。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穿膜細(xì)胞數(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，以血清培養(yǎng)基洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105mL-1，取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell上室，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組下室分別加入含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的FBS完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含藥物FBS完全培養(yǎng)基，每組3復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，上室內(nèi)腫瘤細(xì)胞向下室聚集。24 h后，取出培養(yǎng)板，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，下室細(xì)胞用甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，沖洗封片后，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)為穿膜細(xì)胞數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。

1.7 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，采用含10% FBS的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107mL-1，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別用含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)液，800 r·min-1離心5 min，收集HeLa細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解30 min，超聲破碎，12 000 r·min-1離心分離后取上清液，BCA法進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量，上樣量為50 μg，120 V電泳分離蛋白，PVDF膜上轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗PI3K、Akt和p-Akt(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h，ECL法顯色，用Quanitity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組HeLa細(xì)胞外泌體中外泌體標(biāo)志物CD81和CD63蛋白表達(dá)水平不同劑量鹽酸小檗堿處理HeLa細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P< 0.05)。各組細(xì)胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達(dá)水平與鹽酸小檗堿呈明顯的劑量依賴性。見表1和圖1。

表1 各組HeLa細(xì)胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達(dá)水平

2.2 各組HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率處理24、48和72 h后，與對(duì)照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均明顯升高(P< 0.05);與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均明顯升高(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯升高(P< 0.05)。各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈明顯時(shí)間和劑量依賴性。見表2。

Lane 1: Control group; Lane 2-4: Low, medium, and high doses of berberine hydrochloride groups.

表2 作用24、48和72 h后各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.3 各組HeLa細(xì)胞遷移率與對(duì)照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞遷移率均明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞遷移率均明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞遷移率明顯降低(P< 0.05)。各組細(xì)胞遷移率與鹽酸小檗堿呈劑量依賴性。見表3和圖2。

2.4 各組HeLa細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組(224±19)比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組穿膜細(xì)胞數(shù)(157±13、134±12和109±8)均明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞遷移率明顯降低(P< 0.05)。各組HeLa細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)與鹽酸小檗堿呈劑量依賴性。見圖3(插頁六)。

2.5 各組HeLa細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平不同劑量鹽酸小檗堿處理HeLa細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞中PI3K及p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)。各組細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平與鹽酸小檗堿呈劑量依賴性。見表4和圖4。

3 討 論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，在中國(guó)具有高發(fā)病率和死亡率[9]。近年來研究[10-11]顯示：鹽酸小檗堿可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，如乳腺細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞等。本研究結(jié)果表明：隨著鹽酸小檗堿劑量的增加，宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯升高，具有劑量依賴性，說明鹽酸小檗堿可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，與有關(guān)研究[12-13]結(jié)果一致。腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)涉及多因素、多步驟和多機(jī)制，是目前研究的重點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示：不同劑量鹽酸小檗堿干預(yù)后，宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移、侵襲能力與對(duì)照組比較均明顯降低，且具有劑量依賴性，與李娜等[14]報(bào)道的鹽酸小檗堿具有抑制宮頸癌侵襲能力的結(jié)果一致。

表3 各組HeLa細(xì)胞遷移率

A: Control group; B-D: Low, medium, and high doses of berberine hydrochloride groups.

表4 各組HeLa細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平

Lane 1: Control group; Lane 2-4: Low, medium, and high doses of berberine hydrochloride groups.

外泌體是近年來熱門生物學(xué)研究領(lǐng)域之一，其對(duì)腫瘤的遷移和侵襲有明顯影響[15-16]。研究[17]顯示：外泌體中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移能力。本研究采用超速離心法分離宮頸癌HeLa細(xì)胞外泌體，Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：不同劑量鹽酸小檗堿組癌細(xì)胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯降低，且具有劑量依賴性，說明鹽酸小檗堿能夠抑制宮頸癌細(xì)胞外泌體，從而降低細(xì)胞遷移和侵襲能力。

在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/p-Akt信號(hào)通路被激活。PI3K是異源二聚體蛋白復(fù)合物，由PIK3CA基因編碼的催化亞基p110α亞單位和由PIK3R1基因編碼的調(diào)節(jié)性p85α亞單位構(gòu)成[18]。在腫瘤發(fā)生時(shí)，PI3K介導(dǎo)的信號(hào)通路被異常激活，導(dǎo)致Akt依賴的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[19-20]。陳鳳霞[21]采用免疫組織法檢測(cè)患者宮頸癌組織和癌旁組織中PI3K和Akt表達(dá)水平，結(jié)果顯示：腫瘤組織中PI3K和Akt表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。另有研究[22]表明：p-Akt在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)率明顯升高，并與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。PI3K/Akt活性降低則可以降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果表明：宮頸癌HeLa細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平增加，說明PI3K和Akt是參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的信號(hào)物質(zhì)，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細(xì)胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明Akt磷酸化可作為PI3K活性指標(biāo)，能夠反映PI3K信號(hào)通路的活性，鹽酸小檗堿能夠通過下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，鹽酸小檗堿能夠抑制宮頸癌細(xì)胞分泌外泌體，抑制癌細(xì)胞增殖，降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，但關(guān)于PI3K/Akt信號(hào)通路下游調(diào)控外泌體分泌的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。