唐玉艷

南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南省長(zhǎng)沙市 410000

子癇前期(PRE-eclampsia, PE)是一種發(fā)生在孕產(chǎn)婦妊娠期的全身綜合性疾病，主要發(fā)生在妊娠20周之后，主要特征和表現(xiàn)為高血壓與蛋白尿，常累及重要器官導(dǎo)致多系統(tǒng)并發(fā)癥，發(fā)病率可達(dá)5%～8%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及胎兒死亡的一種主要原因[1-2]。ACK1全稱為活化的Cdc42結(jié)合激酶(Activated Cdc42-binding Kinase)，其基因位于人染色體3q29，蛋白分子全長(zhǎng)1 091個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為120 000[3]。ACK1作為非受體酪氨酸激酶，通過(guò)SAM、Rac、SH3等多個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮生物學(xué)功能[4]。有研究表明ACK1誘導(dǎo)Cdc42調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、腫瘤遷移與侵襲，與惡性腫瘤發(fā)展和預(yù)后有密切相關(guān)[5]。因滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性類(lèi)似于腫瘤細(xì)胞，本研究推測(cè)ACK在調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能方面具有一定聯(lián)系。本研究通過(guò)探究ACK1在足月與PE胎盤(pán)表達(dá)情況及對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的影響，取得了較好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年8月1日—2018年8月1日于本院產(chǎn)科計(jì)劃行剖宮產(chǎn)手術(shù)的32例子癇前期孕婦作為研究組，并選取同期32例正常足月孕婦作為對(duì)照組，分別收集兩組胎盤(pán)組織。符合《2014年ACOG關(guān)于妊娠期高血壓指南》子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入本研究的孕婦在年齡、孕周、身高及體重等基本信息正常，月經(jīng)規(guī)律，第一次妊娠單胎且過(guò)程正常，除子癇前期外排除任何合并癥(原發(fā)性高血壓，心、肝、腎病，糖尿病及癌癥等)與并發(fā)癥。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，且所選孕婦均簽訂知情同意書(shū)。兩組孕婦上述一般資料經(jīng)比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具可比性。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，通過(guò)含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于 5% CO2飽和濕度恒溫箱中37℃條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至約80%時(shí)予以傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞參與實(shí)驗(yàn)。TRIzol和LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國(guó))，ACK1 (SC-323, Santa Cruz Biotechnology, Inc)，一抗 MMP-9、TIMP-2 以及 HRP 標(biāo)記的二抗(Abcam，美國(guó))，Transwell 小室(Millipore，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))。

1.3 方法 本研究中以滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR8/SV neo)作為實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞系，分為常氧對(duì)照組(A組)、缺氧/富氧組(B組)及ACK1基因序列慢病毒敲降組(C組)，具體處理方式如下。A組：采用完全培養(yǎng)基(RPMI 1640 90%，F(xiàn)BS 10%)于5%CO2、20%O2、37℃下培養(yǎng)。B組：常氧培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)染含ACK1敲降序列的慢病毒(購(gòu)于上海吉瑪生物有限公司)[7]。C組：于2%O2培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧培養(yǎng)8 h后，轉(zhuǎn)移至常氧條件(20%O2)培養(yǎng)16 h，共計(jì)2個(gè)循環(huán)[8]。采取免疫組化(IHC)和蛋白免疫印跡法(WB)檢測(cè)胎盤(pán)組織中ACK1的表達(dá)情況。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)分析檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲情況。使用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中ACK1蛋白、金屬蛋白質(zhì)酶(MMP)-9及其特異性抑制因子(TIMP)-2的蛋白表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 ACK1在研究組和對(duì)照組孕婦胎盤(pán)組織中表達(dá)的比較 通過(guò)IHC檢測(cè)，對(duì)照組中ACK1表達(dá)顯著，定位主要顯示在滋養(yǎng)細(xì)胞中，詳見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)兩組孕婦胎盤(pán)組織進(jìn)行Western Blot分析，研究組胎盤(pán)組織中ACK1的表達(dá)含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表1。

圖1 ACK1在研究組和對(duì)照組孕婦胎盤(pán)中IHC檢測(cè)結(jié)果

圖2 研究組和對(duì)照組孕婦胎盤(pán)組織Western Blot分析結(jié)果

表1 ACK1在研究組和對(duì)照組孕婦胎盤(pán)中表達(dá)的比較

2.2 ACK1在缺氧/富氧(H/R)及ACK1基因序列慢病毒敲降(ACK1敲降)處理后滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá) C組轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo細(xì)胞效率為99.81%，可供后續(xù)研究使用。通過(guò)定量分析，H/R和ACK敲降能夠使HTR-8/SVneo細(xì)胞ACK1表達(dá)水平分別降低66%和73%，詳見(jiàn)表2。

表2 A、B、C三組滋養(yǎng)細(xì)胞中ACK1的表達(dá)比較

2.3 ACK1敲降對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的影響 A組未經(jīng)處理HTR-8/SVneo細(xì)胞穿透入小室細(xì)胞數(shù)為112.315±9.877，B組經(jīng)過(guò)H/R處理穿透入小室細(xì)胞數(shù)為36.423±6.871，C組經(jīng)ACK1敲降穿透入小室的細(xì)胞數(shù)為28.971±3.541。B組、C組與A組相比穿透入小室細(xì)胞數(shù)明顯降低，表明侵襲能力顯著降低。此外，B組和C組均能夠減弱MMP-9的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)TIMP的表達(dá)，詳見(jiàn)表3。

表3 A、B、C三組MMP-9和TIMP-2表達(dá)水平比較

3 討論

有研究顯示，在多種惡性腫瘤組織中ACK1表達(dá)量明顯升高，ACK1可以催化某些蛋白酪氨酸磷酸化成活化蛋白，使其發(fā)揮作用，直接促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[9]。但ACK1在子癇前期研究中研究較少，本文研究結(jié)果顯示，研究組胎盤(pán)組織中ACK1的表達(dá)含量明顯低于對(duì)照組，因而推測(cè)ACK1表達(dá)含量降低與發(fā)生子癇前期相關(guān)。

在孕婦妊娠經(jīng)過(guò)中，滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)侵襲子宮蛻膜和子宮螺旋動(dòng)脈，形成滋養(yǎng)細(xì)胞通道，血管的內(nèi)皮細(xì)胞被取代，血管由狹窄、彈性轉(zhuǎn)變成擴(kuò)張并無(wú)彈性的子宮胎盤(pán)血管，子宮螺旋動(dòng)脈重鑄完成，血供能力增加，使絨毛間隙的血流量明顯升高，以保證胎盤(pán)功能正常[10]。子宮螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程中保持滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和增殖能力正常是最為關(guān)鍵的一環(huán)。在各種條件變化的影響下，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲能力降低，直接影響到子宮螺旋動(dòng)脈重鑄過(guò)程，影響血流量的供應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)物(ROS)升高，可能與子癇前期發(fā)病相關(guān)聯(lián)[11]。本研究中，采取對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞進(jìn)行H/R處理，ROS水平顯著升高，以此來(lái)模擬滋養(yǎng)細(xì)胞的H/R狀態(tài)。本研究顯示，通過(guò)對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞分別進(jìn)行H/R和ACK1敲降處理，二種處理方式均能夠使ACK1表達(dá)能力降低，且HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲功能受到很大程度的抑制；表明ACK1基因表達(dá)能力的下降顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能，同時(shí)表明ACK1可能與子癇前期發(fā)病有關(guān)。MMP-9隸屬于金屬蛋白質(zhì)酶的一種，起到降解細(xì)胞基膜的作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲功能方面具有關(guān)鍵作用。有關(guān)于腫瘤細(xì)胞體外研究表明，ACK1表達(dá)量提高的同時(shí)會(huì)提升腫瘤細(xì)胞MMPs的表達(dá)水平，通過(guò)降解細(xì)胞基膜浸潤(rùn)周?chē)M織[12]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞分別進(jìn)行H/R和ACK1敲降處理后，細(xì)胞侵襲能力降低的同時(shí)，二種處理方式下細(xì)胞中MMP-9表達(dá)能力均下降，對(duì)應(yīng)TIMP-2水平提高。

綜上，子癇前期孕婦胎盤(pán)ACK1表達(dá)水平下降可使滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能降低，血管重鑄功能減弱，導(dǎo)致子癇前期發(fā)病。