鄧桃 楊昌貴 周濤

【摘 要】 目的：提升水三七的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對(duì)水三七藥材粉末進(jìn)行鑒別;參照2015年版《中國(guó)藥典》測(cè)定水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物的含量;采用紫外分光光度法，建立水三七總皂苷的定量方法。結(jié)果：淀粉粒、導(dǎo)管和草酸鈣針晶為水三七粉末穩(wěn)定性的顯微特征;17批樣品中，水分為7.38%～8.79%，總灰分為3.26%～7.06%，酸不溶性灰分為0.45%～3.12%，醇溶性浸出物含量為11.52%～22.32%，總皂苷含量為1.39%～4.56%。結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠，可用于水三七的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 水三七;總皂苷;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);提升研究

【中圖分類號(hào)】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）12-0018-05

Abstract：Objective To improve the quality control standard of Rhizoma Schizocapsae. Methods The powder of Rhizoma Schizocapsae was identified by microscopic identification. The contents of water， total ash， acid insoluble ash and alcohol extract were determined with reference to the 2015 edition of Chinese pharmacopoeia. A quantitative method for the determination of total saponins of Rhizoma Schizocapsae was established by UV Spectrophotometer. Results starch granules， catheter and calcium oxalate needle crystals showed the microscopic characteristics of powder stability of Rhizoma Schizocapsae. Among the 17 samples， the water content was 7.38%～ 8.79%， the total ash content was 3.26%～ 7.06%， the acid insoluble ash content was 0.45%～ 3.12%， the alcohol soluble extract content was 11.52%～ 22.32%， and the total saponin content was 1.39%～4.56%. Conclusion the method is stable and reliable， and can be used for quality control of Rhizoma Schizocapsae.

Keywords：Rhizoma Schizocapsae; Total Saponins; Quality Standard;Upgrading Research

水三七又名水田七、屈頭雞、水蘿卜等，為蒟蒻薯科植物裂果薯 Schizocapsa plantaginea Hance.的塊莖，水三七之名始載于《貴州衛(wèi)生》[1]，在《廣西中藥志》《湖南藥物志》中均有記載，主要分布于貴州、湖南、廣西等省區(qū)，為苗族、侗族、水族、瑤族等民族習(xí)用藥物，用于百日咳、食積、胃痛、跌打損傷、咽喉腫痛的治療[2]?，F(xiàn)代藥理和臨床應(yīng)用表明，水三七具有很好的抗腫瘤作用。2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和2014年版《廣西瑤族習(xí)用藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)中[3-5]均僅收載了水三七藥材的來源、性狀等簡(jiǎn)單的質(zhì)控項(xiàng)目，缺少專屬的鑒別方法和藥效成分定量測(cè)定方法，這難以控制藥材質(zhì)量。因此，建立更為完善的水三七藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，顯得非常有必要。

水三七主要化學(xué)成分為甾族皂苷、氨基酸、黃酮和花青色素[6]以及多種甾苦味物質(zhì)[7]，其中總皂苷為其抗腫瘤的主要活性成分，能明顯抑制食管癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[8-11]。因此，本文以總皂苷作為水三七含量測(cè)定的指標(biāo)成分。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)[5，12]，對(duì)顯微鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和總皂苷含量測(cè)定進(jìn)行研究，并對(duì)17批水三七藥材進(jìn)行測(cè)定，制定了合理的限度，為完善水三七質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了方法和依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑 紫外可見分光光度計(jì)（蘇州島津儀器有限公司，型號(hào)UV-2700）;型箱式電阻爐（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)SX-5-12）;電子分析天平（梅特勒科學(xué)儀器公司，型號(hào)EL104，分度值0.1 mg）。

人參皂苷Re對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)52286-59-6，純度98 %）;冰醋酸（上海申博化工有限公司，批號(hào)1803101）、香草醛（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180510）、高氯酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170113）、甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20180802）、無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20180228）均為分析純。

1.2 藥材 水三七藥材采自貴州省羅甸、惠水、荔波、鎮(zhèn)遠(yuǎn)4縣的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室江維克教授鑒定為蒟蒻薯科植物裂果薯 Schizocapsa plantaginea Hance 的塊莖，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 粉末土黃色。淀粉粒類球形、半圓形、類三角形，直徑5～25 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、人字狀，復(fù)粒由2～3分粒組成;草酸鈣針晶散在或成束，長(zhǎng)50～85 μm;螺紋導(dǎo)管可見，直徑8～30 μm。見圖1。

2.2 水分、總灰分、酸不溶性灰分的檢查及醇浸出物的含量測(cè)定 參照2015年版《中國(guó)藥典》第四部通則0832、2302測(cè)定水分、總灰分及酸不溶性灰分的含量;醇浸出物測(cè)定參照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，以55 %乙醇為溶劑。所測(cè)17批藥材水分含量7.38%～8.79%，平均含量7.80%;總灰分含量3.26%～7.06%，平均含量3.89%;酸不溶性灰分含量0.45%～3.12%，平均含量0.72%;醇浸出物含量11.52%～22.32%，平均含量14.44%。結(jié)果見表3。

2.3 水三七總皂苷的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品18.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.744 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取水三七藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入70 %的乙醇25 mL，超聲處理90 min，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，用提取液稀釋至刻度，即得。

2.3.3 顯色條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取0.2 mL“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品溶液于10 mL比色管中，90℃水浴蒸干溶劑，依次精密加入新配置的10%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.6 mL，搖勻，70℃水浴加熱20 min，取出，立即用水迅速冷卻至室溫，加冰醋酸5 mL，以隨行試劑為空白。在200 nm～800 nm范圍掃描，供試品和對(duì)照品均在545 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL，于10 mL比色管中，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色，在545 nm測(cè)定各組吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.027843X+0.127869（r=0.9994），表明人參皂苷Re在6.305 ～ 37.830 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取6份“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL于比色管在，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色，在545 nm測(cè)定各組吸光度，RSD值為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取水三七藥材粉末6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色法測(cè)定吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，平均含量為2.70%，RSD值為2.39%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”下供試品溶液，分別于室溫0 h、0.5 h、1 h、2 h、14 h、18 h按“2.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，RSD值為1.75%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的供試品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入2.23 mg/mL的人參皂苷Re對(duì)照品溶液3 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，回收率為95%～105%間，平均回收率為97.46%，RSD值為1.75%，結(jié)果見表2。

2.3.9 樣品檢測(cè) 取17批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色，在545 nm測(cè)定各組吸光度，計(jì)算各批次樣品中總皂苷的含量，測(cè)定總皂苷含量1.39%～4.56%，平均含量為2.23%，RSD值為37.82%，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 浸出物的測(cè)定 研究表明，水三七醇浸出物具有較好的抗腫瘤效果[8]，控制醇浸出物的含量，對(duì)確保藥材質(zhì)量具有重要意義。本文考察了不同濃度的乙醇（55%、65%、75%、85%、95%）對(duì)浸出物含量的影響，發(fā)現(xiàn)55%乙醇作溶劑，浸出物的含量最高;比較了冷浸法和熱浸法的提取效果，發(fā)現(xiàn)熱浸法的提取效果較冷浸法好，且耗時(shí)短，故選擇以55%乙醇為提取溶劑，熱浸法測(cè)定含量。

3.2 總皂苷含量測(cè)定 水三七總皂苷為抗腫瘤的主要活性成分[9]，參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，筆者對(duì)水三七總皂苷的提取工藝、顯色條件進(jìn)行了優(yōu)選。提取溶劑考察發(fā)現(xiàn)70%甲醇和70%乙醇的提取率相對(duì)較高，且二者差異不顯著，考慮到乙醇毒性較甲醇小，故選擇70%乙醇作為提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，考察了提取方法（超聲提取、回流提?。?，提取時(shí)間（15～105 min）以及溶劑用量（10～70 倍量）對(duì)總皂苷含量的影響，結(jié)果表明50倍量的70%乙醇超聲提取90 min可將總皂苷提取完全，所建立的供試品制備方法相較文獻(xiàn)報(bào)道的水浴回流4小時(shí)提取，不僅節(jié)約時(shí)間，而且提取率高、操作簡(jiǎn)便。顯色條件考察了不同水浴揮干溫度（70℃、80℃、90℃）對(duì)總皂苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)揮干溫度對(duì)總皂苷含量無顯著性的影響，從節(jié)約時(shí)間的角度考慮，把水浴揮干溫度定為90℃，相較于文獻(xiàn)用70℃揮干溶劑，極大的節(jié)約了時(shí)間。接著對(duì)顯色劑濃度和用量、顯色溫度及時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)選，結(jié)果表明采用10%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.6 mL，在70℃下水浴20 min顯色，能充分反應(yīng)，方法重復(fù)性良好。

3.3 限量標(biāo)準(zhǔn)制定 根據(jù)17批水三七藥材的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，水分、總灰分、酸不容性灰分按不高于平均值的120%制定標(biāo)準(zhǔn)限度，建議水分含量不得過9.0%，總灰分含量不得過5.0%，酸不溶性灰分含量不得過1.0%;浸出物、總皂苷按不低于平均值的80%制定標(biāo)準(zhǔn)限度，建議醇溶性浸出物含量不得少于12.0%，總皂苷含量以人參皂苷Re計(jì)，不得少于2.0%。

本文對(duì)水三七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，相較于已有標(biāo)準(zhǔn)[3]，增加了“顯微鑒別”、“水分”、“總灰分及酸不溶性灰分”、“浸出物”和“含量測(cè)定”等項(xiàng)。且建立的質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單易行，能夠準(zhǔn)確、科學(xué)地評(píng)價(jià)水三七質(zhì)量，為水三七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了方法和依據(jù)。參考文獻(xiàn)

[1]陳濟(jì)中，蔡厚力.草藥“水三七”臨床療效的初步觀察[J].貴州衛(wèi)生，1959（4）：19-20.

[2]汪毅編著.黔本草[M].第1卷.貴陽(yáng)：貴州科技出版社， 2015.3（1）：277-278.

[3]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2003年版）[S].貴陽(yáng)：貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2003：105.

[4]湖南省食品藥品監(jiān)督管理局編.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S]. 2009年版.長(zhǎng)沙：湖南科技出版社，2010.02.266.

[5]廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2014：38-39.

[6]唐世蓉，龐自潔，吳余芳，等.南京中山植物園研究論文集[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1980：122.

[7]歐明春，孫悅文，劉布鳴，等.裂果薯醇提取物對(duì)人肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)與血管生成的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（4）：106-110.

[8]邱漢琛，孫悅文，羅舜仁，等.裂果薯總皂苷對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性作用[J].山東醫(yī)藥，2017，57（15）：1-4.

[9]孫悅文.廣西特色中草藥靶向抗腫瘤篩選及裂果薯皂苷的分離與抗腫瘤作用研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2013.

[10]YUE W， HAN C， MING C， et al. Saponins isolated from Schizocapsa plantaginea inhibit human hepatocellular carcinoma cell growth in vivo and in vitro via mitogen-activated protein kinase signaling[J]. Chin J Nat Med， 2018（1）：29-40.

[11]羅舜仁，邱漢琛，陳燕燕，等.裂果薯皂苷的特征圖譜及總皂苷中有效組分的抗腫瘤活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018（30）：294-298.

[12]黃媛恒，黃曉亮，黃永運(yùn)，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選水田七總皂苷的提取工藝研究[J].蛇志， 2018， 30（2）：180-181.

（收稿日期：2020-03-15 編輯：劉 斌）