景永帥 金 姍 張丹參 張瑞娟王非凡 鄭玉光 吳蘭芳

(1. 河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200)

北沙參(GlehniaRadix)為傘形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的干燥根，是常用的補(bǔ)陰補(bǔ)氣食材，具有養(yǎng)陰潤肺功能[1]。它是衛(wèi)生部公布的藥食兩用資源，主要分布在河北、山東和內(nèi)蒙古等地。北沙參中含有揮發(fā)油類、香豆素類、多糖類和聚炔類等化學(xué)成分，其中多糖類含量最高，也是其主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤等作用[2-3]。

乙醇分級沉淀法是制備多糖常用的提取純化方法，它是將原料熱水浸提后逐步提高乙醇的體積濃度來純化多糖，多糖的得率和組成隨著乙醇在醇沉?xí)r濃度的不同而變化[4]。此法優(yōu)勢在于成本低、耗時短，同時又能維持較高得率，且不同乙醇濃度沉淀得到的多糖具有不同的生物活性及應(yīng)用價值[5]。實(shí)驗(yàn)室[2,6-7]前期優(yōu)化了北沙參粗多糖的提取工藝，并發(fā)現(xiàn)北沙參多糖具有較好的清除自由基活性。

目前，關(guān)于北沙參乙醇分級純化多糖的研究尚未見報道，為了尋找一種簡單高效純化北沙參多糖組分的方法，更好地探究成分與活性之間的關(guān)系。在前期研究[2,7]的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)擬以北沙參為研究對象，提取北沙參中多糖成分，并用終濃度為30%，50%，70%的乙醇對多糖進(jìn)行分級純化，制備得到4種不同組分的北沙參多糖，并測定4種組分多糖的可溶性總糖含量、蛋白含量、黏度、保水性、保油性、單糖組成、抗氧化活性等，以期為北沙參多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

北沙參：河北安國產(chǎn)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室鄭玉光教授鑒定為傘形科珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的根；

3,5-二硝基水楊酸：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

考馬斯亮藍(lán)：分析純，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

金龍魚油：益海嘉里食品營銷有限公司；

DPPH：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

硫酸亞鐵：分析純，恒誠化工有限公司；

過氧化氫：分析純，天津政成化學(xué)制品有限公司；

苯酚：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外—可見分光光度計：UV-752型，上海光譜儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：S-100型，珀金埃爾默儀器有限公司；

液相色譜儀：LC1220型，安捷倫科技(中國)有限公司；

液相色譜儀：e2695型，美國Alliance公司；

場發(fā)射掃描電鏡：S-4800-1型，株式會社日立制作所；

差熱—熱重聯(lián)用熱分析儀：STD-2960型，美國TA儀器公司；

旋轉(zhuǎn)黏度計：NDJ-1型，上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 北沙參各分級醇沉多糖制備 取粉碎后的北沙參于80 ℃水浴鍋中，用3倍體積80%乙醇除脂2次，干燥備用。稱取一定量除脂后的北沙參，用30倍體積蒸餾水回流加熱提取2次，合并提取液，冷卻抽濾，旋蒸至黏稠態(tài)，加無水乙醇使乙醇終濃度為30%，冷藏過夜，離心，將沉淀干燥得30%組分多糖GLP-30。離心后的液體旋蒸，回收乙醇至液體黏稠，再加入無水乙醇使乙醇終濃度為50%進(jìn)行醇沉，冰箱過夜，離心后將沉淀干燥得50%組分多糖GLP-50。同樣的操作步驟得GLP-70，對70%濾液進(jìn)行旋蒸回收乙醇，裝入透析袋(截留分子量為3 000 Da)，流水、蒸餾水依次透析24 h，蒸干得剩余組分多糖命名為GLP-剩余。

1.2.2 多糖可溶性總糖含量、蛋白質(zhì)含量的測定

(1) 可溶性總糖含量：采用苯酚—硫酸法[8]。

(2) 蛋白含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[9]。

1.2.3 黏度的測定 分別配制濃度為0.5，1.0 mg/mL的多糖粗品溶液各300 mL，室溫條件下，旋轉(zhuǎn)黏度計的剪切速率為60 s-1條件下，測定其表觀黏度[10]。

1.2.4 保水性和保油性的測定 參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.5 紫外—可見光譜分析 取2.5 mg各多糖組分加適量蒸餾水溶解定容于25 mL容量瓶，在200～800 nm范圍內(nèi)用紫外—可見分光光度計掃描。

1.2.6 紅外光譜掃描 取多糖樣品與干燥的KBr粉末研磨均勻，壓成薄片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.7 微觀形態(tài)測定 分別取4種多糖通過導(dǎo)電帶吸附至樣品臺上，經(jīng)噴金處理后，場發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行分析，加速電壓3.0 kV，分辨率7.2 mm，分別放大幾個倍數(shù)，拍攝并記錄各多糖的固體形貌。

1.2.8 差示掃描量熱分析和熱解重量分析 分別稱取各多糖組分2.0 mg，升溫速率10 ℃/min，升溫至800 ℃，進(jìn)行差示掃描量熱分析(DSC)和熱解重量分析(TGA)。以溫度、失重率(某一溫度下失重后樣品的實(shí)測質(zhì)量與樣品總質(zhì)量的比值)分別為X、Y軸，繪制熱重變化曲線[10]。

1.2.9 單糖組成分析 選取8種單糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖)作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)文獻(xiàn)[12]略作修改，Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm250 mm，5 μm)；檢測波長245 nm；柱溫30 ℃；上樣量20 μL；流速1 mL/min；流動相為磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH為6.85)—乙腈(83∶17，體積比)；洗脫方式為等度洗脫。

1.2.10 分子量的測定 采用凝膠滲透色譜(GPC)測定北沙參各多糖的分子量。分別稱取5 mg標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T5 000、T50 000、T150 000、T270 000，加5.0 mL蒸餾水溶解，分別上G-100凝膠色譜柱。待樣品滲下后，加入3倍體積蒸餾水滲下，關(guān)閉色譜柱下方管口，加滿蒸餾水，裝好柱頭。打開恒流泵開始洗脫。設(shè)置自動部分收集器使每管收集10 mL。以有效分配系數(shù)Kav為縱坐標(biāo)，lgM為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，Kav根據(jù)式(1)計算：

(1)

式中：

Kav——有效分配系數(shù)；

Ve——待測樣品的洗脫體積，mL；

V0——用藍(lán)色葡聚糖確定凝膠柱的空體積，mL；

Vt——葡萄糖確定凝膠柱的總柱體積，mL。

配制5 mL濃度為1.0 mg/mL的多糖溶液，按上述方法加樣，裝柱頭之前收集的體積記作前體積。收集完畢后測量各管體積，苯酚—硫酸法測定各管吸光度，檢測樣品出峰液分布情況，求出相應(yīng)峰體積，計算出Kav。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出各多糖分子量及分布[13]。

1.2.11 DPPH自由基和羥基自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 北沙參分級多糖的提取率、可溶性總糖含量、蛋白質(zhì)含量和黏度

經(jīng)乙醇分級得到4個北沙參多糖GLP-30、GLP-50、GLP-70和GLP-剩余，分別測定各組分多糖的得率、可溶性總糖含量、蛋白含量、黏度、保水保油性等，結(jié)果如表1所示。

由表1可知：

表1 北沙參各分級醇沉多糖的得率及理化性質(zhì)

(1) 隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，北沙參多糖的可溶性總糖含量降低，乙醇分級后的水提取中多糖為主要成分，含有少量蛋白質(zhì)。GLP-30中可溶性總糖含量最高，蛋白質(zhì)含量最少。

(2) 在多糖濃度相同時，分級多糖黏度大小為GLP-70>GLP-剩余>GLP-50>GLP-30。分級多糖的黏度具有濃度依賴性，隨多糖濃度的增大，4種多糖的黏度均變大。多糖黏度受分子間的聚集、相對分子質(zhì)量大小和成分組成相互作用影響[15]。

(3) 保水量大小為：GLP-30>GLP-70>GLP-50>GLP-剩余。保油量反映水膠體的功能特性，代表吸油能力。保油量大小為：GLP-50>GLP-70>GLP-30>GLP-剩余。多糖或蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有許多親水基團(tuán)，如羥基、羧基、羧酸根等，這些基團(tuán)水化后會形成黏稠膠體溶液，從而提高保水性和保油性。同時蛋白質(zhì)分子間具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過大分子鏈上大量的親油基團(tuán)的作用，油分子被包裹在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，從而達(dá)到吸油保油的目的[16]。GLP-30具有較好的保水性，說明其結(jié)構(gòu)中含有較多的親水基團(tuán)；GLP-50表現(xiàn)出較好的保油性，可能是由于其蛋白含量相對較高。

2.2 紫外—可見光譜分析

如圖1所示，4個組分的紫外掃描圖譜相似，均在280 nm 處有蛋白質(zhì)的特征吸收峰[5]，且吸收峰的強(qiáng)弱順序?yàn)镚LP-剩余>GLP-50>GLP-70>GLP-30，表明這4種多糖均含有一定量的蛋白質(zhì)，與考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量結(jié)果基本一致。各樣品在510 nm波長處均沒有吸收，說明多糖中不存在黃酮類物質(zhì)。

圖1 北沙參各分級醇沉多糖的紫外—可見光譜圖

2.3 紅外光譜分析

由圖2可知，各組分多糖紅外光譜波峰趨勢相似，在3 400 cm-1附近具有較寬的吸收峰，為O—H的伸縮振動。2 930 cm-1處較弱的吸收峰是由C—H的伸縮振動引起的，1 637 cm-1附近出現(xiàn)的可能是O—H的彎曲振動吸收峰、C—O吸收峰或糖醛酸的COO—非對稱伸縮振動吸收峰，1 021 cm-1處為醚鍵的吸收峰，849 cm-1處為α-糖苷鍵的吸收峰[17]，均具有多糖的特征吸收峰。

圖2 北沙參各分級醇沉多糖的紅外光譜圖

1 419 cm-1附近較小的吸收峰是N—H彎曲振動和C—N 伸縮振動的酰胺Ⅱ特征峰，表明分級多糖中有少量蛋白與糖結(jié)合[18]。GLP-30與其他3個組分在950～1 450 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰有一定差別，提示GLP-30蛋白含量較低，與考馬斯亮藍(lán)法測定結(jié)果一致。

2.4 掃描電子顯微鏡分析

從圖3可以觀察到4個組分的固體形貌有一定差異性，GLP-30孔洞較大，表面高低不平有凸起堆疊。GLP-50孔洞較少，表面輕微凸起，較為光滑。GLP-70表面有大部分凸起，呈碎屑狀堆積，顆粒較大，有較多孔洞，表面最為粗糙，可能與其黏度較大有一定關(guān)系。GLP-剩余表面光滑，質(zhì)地緊致。

圖3 北沙參各分級醇沉多糖的掃描電鏡圖

2.5 差示掃描量熱—熱重分析

根據(jù)差示掃描量熱曲線(DSC)可以看出吸熱峰和放熱峰數(shù)量。根據(jù)熱重曲線(TGA)可以了解北沙參多糖熱裂解溫度以及發(fā)生失重次數(shù)，在該區(qū)域溫度，多糖發(fā)生了分解，化學(xué)鍵受到了破壞[19]。GLP-30、GLP-50、GLP-70、GLP-剩余的差示掃描量熱—熱重圖譜如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)加熱溫度從40 ℃升溫至400 ℃時，4個組分均首先出現(xiàn)一個吸熱峰隨后出現(xiàn)一個放熱峰[20]。分析吸熱峰的出現(xiàn)可能是由于多糖的吸水、熔化或者分解。隨著溫度的升高，多糖先發(fā)生失水過程，GLP-30、GLP-50、GLP-70、GLP-剩余分別于307.06，289.27，282.93，304.06 ℃ 發(fā)生分解，最后剩余的重量是灰分。4種組分的差示掃描量熱結(jié)果相差較大，說明各組分多糖的糖鏈空間結(jié)構(gòu)差別較大。

圖4 北沙參各分級醇沉多糖的差示掃描量熱—熱重圖

2.6 單糖組成

由圖5和表2可知，4種組分多糖中GLP-30、GLP-50主要含有半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。GLP-70、GLP-剩余主要含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。試驗(yàn)結(jié)果與杜寶香等[21]和任浩娜[22]所得的結(jié)果類似，但未檢測到葡萄糖醛酸和鼠李糖，可能是由北沙參的產(chǎn)地差異性和其含量較低導(dǎo)致。

1. Man甘露糖 2. Rha鼠李糖 3. GlcUA葡萄糖醛酸 4. GalUA半乳糖醛酸 5. Glc葡萄糖 6. Gal半乳糖 7. Xyl木糖 8. Ara阿拉伯糖

表2 北沙參各分級醇沉多糖的單糖組成和含量比

2.7 分子量

測得標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，有效分配系數(shù)(Kav)與lgM呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.409 4x+2.321 2，R2=0.998 77。

以峰值數(shù)據(jù)管數(shù)的總體積V為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制特征圖譜，如圖6所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得多糖樣品分子量大小，如表3所示。分子量大小為：GLP-30>GLP-50>GLP-70>GLP-剩余，不同濃度的乙醇分級得到的北沙參多糖的分子量不同，隨著乙醇濃度的增大分子量逐漸降低。李紅法等[23]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖分子量的變化，與試驗(yàn)結(jié)果一致，可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化會影響沉淀中多糖的結(jié)構(gòu)。

表3 北沙參各分級醇沉多糖分子量分布及其大小

圖6 北沙參各分級醇沉多糖組分的凝膠滲透色譜圖

2.8 抗氧化活性

2.8.1 清除DPPH自由基 由圖7可知，隨著糖濃度的增加，GLP-30、GLP-50、GLP-70和GLP-剩余對DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性。半數(shù)清除率(IC50)值最小，說明其清除自由基能力最強(qiáng)。4種多糖及VC清除DPPH自由基能力的大小為：VC(0.005 mg/mL)>GLP-50 (0.123 mg/mL)>GLP-剩余 (0.299 mg/mL)>GLP-70 (0.364 mg/mL)>GLP-30 (1.822 mg/mL)，上述結(jié)果表明北沙參多糖具有較好的清除DPPH自由基的能力。

圖7 北沙參各分級醇沉多糖對DPPH自由基清除作用

2.8.2 清除羥基自由基 如圖8所示，4種多糖對羥基自由基清除能力均隨濃度的增加而增大，并有良好線性關(guān)系。清除羥基自由基能力大小為VC(0.072 mg/mL)>GLP-50 (3.809 mg/mL)>GLP-30 (5.105 mg/mL)>GLP-70 (6.151 mg/mL)>GLP-剩余 (10.529 mg/mL)。4種多糖均低于陽性對照VC的IC50值。上述結(jié)果表明，北沙參多糖具有一定的羥基自由基清除能力，與周紅英等[1]的研究一致。

圖8 北沙參各分級醇沉多糖對羥基自由基清除作用

多糖抗氧化的構(gòu)效關(guān)系會受到分子量、蛋白含量、糖醛酸含量、活性羥基數(shù)量、分子構(gòu)象等方面的影響。王佳等[5]報道虎杖、麻黃和甘草多糖的抗氧化活性與糖醛酸含量呈正相關(guān)。許海棠等[24]報道山豆根多糖的抗氧化活性與其純度，以及多酚和蛋白含量等有關(guān)。試驗(yàn)中GLP-50也表現(xiàn)出類似結(jié)果，因此分析半乳糖醛酸的含量較高是其抗氧化活性高的主要原因，同時也受蛋白含量影響。另外，GLP-50清除DPPH自由基的IC50值為0.123 mg/mL，對比實(shí)驗(yàn)室前期制備的北沙參粗多糖的清除DPPH自由基的IC50值(1.99 mg/mL)[7]，經(jīng)乙醇分級沉淀后的多糖清除DPPH自由基效果明顯提高。說明乙醇分級沉淀后的北沙參多糖在清除DPPH自由基功效方面具有良好利用價值。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用一種簡單、高效的方法——乙醇分級沉淀法純化北沙參多糖，得到GLP-30、GLP-50、GLP-70和GLP-剩余4個組分，經(jīng)研究顯示，不同濃度乙醇沉淀會影響北沙參多糖的得率、單糖組成、蛋白含量、分子量、黏度等理化性質(zhì)，從而改變多糖的生物活性，各多糖組分分子量隨乙醇濃度的增加而逐漸降低；GLP-50表現(xiàn)出最高得率和最好的抗氧化活性，其半乳糖醛酸含量最高并且含有較多的蛋白質(zhì)。因此，推測半乳糖醛酸的含量較高是北沙參抗氧化活性高的主要原因，同時也受蛋白含量影響。綜上，50%乙醇更適宜沉淀制備北沙參多糖，且所得多糖的抗氧化性比北沙參粗多糖的活性較強(qiáng)。后續(xù)研究可進(jìn)一步深入解析北沙參多糖結(jié)構(gòu)并探索其體內(nèi)抗氧化活性功能，為北沙參多糖的構(gòu)效關(guān)系研究和產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。