趙軍 謝靜華 李昕 師建平 常虹

女性卵巢功能在其絕經(jīng)后減退致雌激素不足是公認(rèn)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)病因，替代雌激素療法(hstrogen replacement therapy，HRT)是治療PMOP的首選療法，其作用機(jī)制與強(qiáng)化骨密度(bone mineral density，BMD)和全身骨礦量有關(guān)[1-2]。鑒于女性長期服用傳統(tǒng)雌激素藥物所引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此尋找一種平穩(wěn)、安全、有效的治療方法來替代雌激素藥物對防治PMOP意義重大?；谡n題組的前期研究，本實(shí)驗(yàn)通過觀察藍(lán)刺頭對去卵巢大鼠BMD、血清DHEA、腎上腺CYP450的作用，研究蒙藥藍(lán)刺頭通過調(diào)節(jié)雌激素轉(zhuǎn)化酶、前體物質(zhì)，經(jīng)ER介導(dǎo)非經(jīng)典途徑防治PMOP的作用機(jī)制，為深入探討蒙醫(yī)“補(bǔ)暖補(bǔ)精—清鎮(zhèn)赫依—固骨質(zhì)壯骨”理論，以及PMOP的有效防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5月齡Wistar雌性大鼠56只，體重(280±30)g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001，飼養(yǎng)條件一致，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，開始復(fù)制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

蒙藥藍(lán)刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司提供；強(qiáng)骨膠囊由北京岐黃制藥有限公司提供(規(guī)格：0.25 g/粒，30粒/瓶，批號(hào)：131204)；己烯雌酚片由合肥久聯(lián)制藥有限公司提供(規(guī)格：0.5 mg/片，批號(hào)：20181020)。

DHEA試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：201806213)；CYP450試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：201807584)；DAB顯色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：1350345)；PBS緩沖液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：1346150607)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，將56只Wistar大鼠隨機(jī)分為強(qiáng)骨膠囊組、蒙藥藍(lán)刺頭低、中、高劑量組、假手術(shù)組、己烯雌酚組、模型組，共7組，每組8只。制備PMOP大鼠模型，10%水合氯醛溶液350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板；下腹部備皮-常規(guī)消毒-正中線2 cm開腹。腹腔底部找到宮頸-兩側(cè)子宮末端找到卵巢(注意子宮呈倒立“人”字形)-完全切除-回納腹腔內(nèi)容物-止血逐層縫合-消毒。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備同上，開腹后僅將卵巢從腹腔提出而不切除(僅切除卵巢周圍少量脂肪組織)[3]。

1.4 造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)文獻(xiàn)[4-5]觀察大鼠陰道涂片，確定造模是否成功，動(dòng)物摘除卵巢后 5天，逐只進(jìn)行陰道上皮角化實(shí)驗(yàn)檢查，1 次/天，連續(xù)觀察動(dòng)情周期 5天，陰道涂片染色后顯微鏡下觀察，均表現(xiàn)為動(dòng)情間期(大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞) ，表示動(dòng)物造模成功。56只PMOP動(dòng)物模型全部造模成功。

1.5 藥物制備及給藥方法

造模成功大鼠飼養(yǎng)90天后開始給藥灌胃。因大鼠體重均大于200 g，故蒙藥藍(lán)刺頭低、中、高劑量組據(jù)人鼠體重比、人鼠代謝速率比計(jì)算后分別以27.500 mg/mL、13.750 mg/mL、6.875 mg/mL劑量灌胃給藥，臨床等效劑量以低劑量組為準(zhǔn)，低、中、高劑量比為1∶2∶4；己烯雌酚灌胃劑量為0.0313 mg/mL，強(qiáng)骨膠囊灌胃劑量為23.4375 mg/mL，均是按成人有效劑量給藥；假手術(shù)組、模型組灌胃等體積的生理鹽水，為配藥方便，按每日大鼠每1 g體重灌胃0.02 mL進(jìn)行計(jì)算(因大鼠胃容積有限，因此每日灌胃在限定液體體積的情況下，考慮每日灌胃藥量)。灌胃連續(xù)90天。

1.6 檢測指標(biāo)

(1)采用顯微CT(Micro-CT)對所有大鼠右側(cè)股骨近端干骺端BMD計(jì)量學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析；(2)大鼠血清脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定；(3)行免疫組化染色法觀察大鼠腎上腺CYP450的表達(dá)，每組大鼠取5張切片(n0)，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(n1)，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠的染色情況(此實(shí)驗(yàn)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 右側(cè)股骨骨密度(BMD)計(jì)量學(xué)變化

模型組與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.01)；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、假手術(shù)組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組相比差別明顯(P<0.05)；蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組相比相比差別不明顯(P>0.05)；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組與蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組相比區(qū)別顯著(P<0.05)；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)。見表1。

表1 各組去卵巢大鼠右側(cè)股骨近端干骺端骨密度計(jì)量學(xué)結(jié)果比較

2.2 血清DHEA變化的比較

與假手術(shù)組相比，模型組血清DHEA水平顯著降低(P<0.01)。同模型組比，用藥以后藍(lán)刺頭中、高劑量組、己烯雌酚組、強(qiáng)骨膠囊組的血清DHEA水平均顯著升高(P<0.01)；蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組血清DHEA水平增加，但無明顯差異(P>0.05)。與己烯雌酚組比，藍(lán)刺頭中、高劑量組血清DHEA水平升高，但差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與強(qiáng)骨膠囊組比，藍(lán)刺頭中劑量組血清DHEA水平升高，藍(lán)刺頭低、高劑量組血清DHEA水平降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血清DHEA水平藍(lán)刺頭低、中、高劑量的組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。己烯雌酚組與強(qiáng)骨膠囊組相比，無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組去卵巢大鼠血清DHEA變化比較

2.3 腎上腺CYP450變化

由圖1、表3可得出，與假手術(shù)組相比，模型組腎上腺CYP450的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，蒙藥藍(lán)刺頭中、高劑量組、己烯雌酚組、強(qiáng)骨膠囊組腎上腺CYP450的表達(dá)均明顯增多(P<0.01)；與模型組比，藍(lán)刺頭低劑量組腎上腺CYP450的表達(dá)明顯增多(P<0.05)。與己烯雌酚組相比，強(qiáng)骨膠囊組、藍(lán)刺頭中劑量組腎上腺CYP450表達(dá)升高，藍(lán)刺頭低、高劑量組表達(dá)降低，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與強(qiáng)骨膠囊組相比，藍(lán)刺頭中劑量組腎上腺CYP450表達(dá)升高，己烯雌酚組、藍(lán)刺頭低、 高劑量組表達(dá)降低， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組腎上腺CYP450的表達(dá)均高于藍(lán)刺頭低、高劑量組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低、高劑量組間比較，差異不明顯(P>0.05)。己烯雌酚組腎上腺CYP450表達(dá)比強(qiáng)骨膠囊組高，但差異不顯著(P>0.05)。

注：A藍(lán)刺頭高劑量；B藍(lán)刺頭中劑量組；C藍(lán)刺頭低劑量組；D強(qiáng)骨膠囊組；E己烯雌酚組；F模型組；G 假手術(shù)組。

圖1 各組去卵巢大鼠光鏡下腎上腺CYP450結(jié)果觀察(免疫組化×400)

表3 各組去卵巢大鼠腎上腺CYP450表達(dá)的情況比較

3 討論

婦女圍絕經(jīng)期綜合征免疫功能低下是因?yàn)槊庖呋钚约?xì)胞獲得不了雌激素生理劑量刺激，雌激素下降會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)DHEA濃度明顯下降，引起神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，發(fā)生本病根本病機(jī)在于腎虛，尤其腎精虧虛，病位在腎、脾、肺。DHEA屬雌雄激素的前體物質(zhì)，是一種多功能的緩沖激素，對人體各個(gè)系統(tǒng)作用廣泛[7-9]。CYP450主要作用將雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮、雌二醇(E2)[10-11]。正常骨代謝呈平衡動(dòng)態(tài)，由成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收相互偶聯(lián)。絕經(jīng)后婦女雌激素水平下降并逐步打破骨吸收與成骨的平衡，這是PMOP發(fā)病的主要原因[12]。蒙藥藍(lán)刺頭作為常用接骨藥之一，臨床實(shí)踐已證明，藍(lán)刺頭有壯骨、接骨愈傷的功效。蒙醫(yī)在治療骨折時(shí)慣用內(nèi)服蒙藥藍(lán)刺頭復(fù)方制劑、煎劑，療效明顯。植物雌激素(phytoestrogen，PE)活性物質(zhì)具有弱雌激素樣作用，可補(bǔ)充女性部分雌激素以減少絕經(jīng)后骨量丟失，可作為替代傳統(tǒng)雌激素的療法，為PMOP的防治提供一種較有效、安全的新方法。蒙藥藍(lán)刺頭可通過調(diào)節(jié)雌激素樣作用，促進(jìn)骨形成，調(diào)節(jié)成骨、骨吸收偶聯(lián)，減少骨轉(zhuǎn)換率，從而達(dá)到防治PMOP的目的[5，13-15]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組腎上腺CYP450的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，蒙藥藍(lán)刺頭中、低、高劑量組、己烯雌酚組、強(qiáng)骨膠囊組腎上腺CYP450的表達(dá)均明顯增多(P<0.05)。與己烯雌酚組相比，強(qiáng)骨膠囊組、藍(lán)刺頭中劑量組腎上腺CYP450表達(dá)升高，藍(lán)刺頭低、高劑量組表達(dá)降低，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。得出結(jié)論，藍(lán)刺頭與西藥、對照藥作用相同，都可加強(qiáng)CYP450在腎上腺的表達(dá)；蒙藥藍(lán)刺頭適當(dāng)濃度具有增強(qiáng)CYP450腎上腺的表達(dá)作用；本研究從大鼠腎上腺角度說明蒙藥藍(lán)刺頭具類雌激素樣作用，對防治PMOP具有一定優(yōu)勢。

綜上所述，在前期課題研究基礎(chǔ)上，本研究通過觀察蒙藥藍(lán)刺頭對PMOP大鼠血清DHEA、BMD、腎上腺CYP450表達(dá)的作用，表明蒙藥藍(lán)刺頭具有調(diào)節(jié)促進(jìn)雌激素轉(zhuǎn)化酶、前體物質(zhì)高效表達(dá)作用，對PMOP大鼠OP治療作用顯著；防治PMOP通過調(diào)節(jié)雌激素介導(dǎo)非經(jīng)典途徑；同時(shí)，雌激素可促成骨細(xì)胞形成，進(jìn)而防治PMOP。芳香化酶為雌激素形成的限速酶，其可減少局部組織的活性，并降低該組織雌激素水平，進(jìn)而引起OP的發(fā)生，而人工干預(yù)芳香化酶表達(dá)依賴于深入研究其基因機(jī)制，從而有利于通過干預(yù)芳香化酶防治OP。當(dāng)前需要對其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，以揭開其分子機(jī)制，為深入探討中醫(yī)“腎主骨”理論、防治PMOP提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床。