侯小林，吳桐忠，李 偉，張星星，黃佐興，黃 新，韓猛立

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師北屯市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆北屯 836000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000）

肉牛運(yùn)輸應(yīng)激綜合征（transport stress syndrome of beef cattle，TSSBC）俗稱“爛肺病”，是指因長途販運(yùn)過程中出現(xiàn)多種應(yīng)激原，如熱、冷、風(fēng)、雨、饑、渴、擠壓、驚嚇、顛簸、合群、調(diào)料、體力耗費(fèi)、環(huán)境改變、潛在疾病等，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，病原微生物，如支原體、巴氏桿菌、肺炎球菌、大腸桿菌等趁虛而入，引起呼吸道、消化道乃至全身病理性反應(yīng)的綜合征候群，如體溫升高、精神沉郁、食欲減退、被毛粗亂、咳嗽、氣喘、流黏性或膿性鼻液、拉稀、血便、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、極度消瘦，甚至衰竭死亡[1-3]。在沒有專業(yè)指導(dǎo)和提前預(yù)防的情況下，不同地區(qū)間調(diào)運(yùn)的牲畜，經(jīng)過長途運(yùn)輸?shù)竭_(dá)目的地后，由于運(yùn)輸過程的多樣性、復(fù)雜性等，會(huì)出現(xiàn)不同程度的發(fā)病。

2019 年新疆兵團(tuán)第十師某基層團(tuán)場(chǎng)購自東北地區(qū)某地的12～14月齡西門塔爾后備生產(chǎn)母牛到場(chǎng)3～5 d 后集中發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為體溫升高（41.2～41.7 ℃）、精神沉郁、流涎、食欲廢絕、反芻停止，繼而腹痛、下痢、干咳、腹式呼吸，牛只臨死前體溫下降、呼吸困難；病程較短，一般為3～5 d，發(fā)病率為25.11%（169/673），病死率為81.65%（138/169），多數(shù)為急性死亡，治愈牛只多數(shù)后期生長不良。本研究應(yīng)用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定、分子生物學(xué)技術(shù)和血清學(xué)技術(shù)，明確引起長途運(yùn)輸肉牛發(fā)生不明原因大規(guī)模死亡的病原因素，掌握運(yùn)輸應(yīng)激誘發(fā)動(dòng)物發(fā)病的臨床特點(diǎn)和致病特性，為后續(xù)制定綜合防控措施提供技術(shù)支撐和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與標(biāo)準(zhǔn)菌株 無菌采集病死牛心血、肺臟、肝臟、淋巴結(jié)等病料，-20 ℃冷凍備用。標(biāo)準(zhǔn)牛多殺性巴氏桿菌（CVCC393，簡稱標(biāo)準(zhǔn)株），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 5%綿羊血液瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 質(zhì)粒提取試劑盒、pMD 19-T（simple）、DL 2 000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；快速革蘭氏染色液、瑞氏-姬姆薩染色液，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)及其配套細(xì)菌生化鑒定卡，為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。臨床常用新藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 引物合成 參照Townsend等[4]、Hoelzle等[5]、韓猛立等[6]、徐淑菲等[7]的方法，合成多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm），牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis），牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV），牛傳染性鼻氣管炎病毒（bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV）的擴(kuò)增引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增片段大小見表1。

表1 4 種病原的PCR 擴(kuò)增引物序列

1.2 方法

1.2.1 解剖和染色鏡檢 剖檢病牛，將病料組織觸片，如心血、肺臟、肝臟，分別進(jìn)行革蘭氏和瑞氏染色鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 將無菌采集的病死牛心血、肺臟、肝臟組織樣品分別接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h 后，再接種于麥康凱瓊脂平板、5%綿羊血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察不同培養(yǎng)基上的生長情況、菌落形態(tài)及溶血情況。

1.2.3 生化鑒定 挑取典型菌落進(jìn)行分離純化，聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)生化鑒定與全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.2.4 支原體和相關(guān)病毒PCR 鑒定 將肺臟組織參照文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的辦法進(jìn)行前期處理，應(yīng)用PPLO 固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，挑取典型菌落進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增；對(duì)采集的病牛血液參照文獻(xiàn)[6-7]中的方法進(jìn)行BVDV、IBRV 的PCR 檢測(cè)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 按照常規(guī)方法進(jìn)行，使用杭州濱河微生物試劑有限公司生產(chǎn)的臨床常用藥敏紙片，采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B 法）進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖解

病死牛剖解病變主要表現(xiàn)為：肺部淤血腫大，呈暗紅色（圖1-A），切開后流出纖維素性浸出液，切面呈大理石狀，部分出現(xiàn)胸壁粘連，肺心葉有多個(gè)黃豆大、黃白色壞死灶，胸腔積液；肝臟腫大，表面有灰白色壞死灶；膽囊顯著腫大；心外膜、心冠脂肪有出血斑點(diǎn)，尤以心耳出血明顯（圖1-B）；淋巴結(jié)水腫、出血，腸道廣泛性出血。

圖1 病死牛剖解病理變化

2.2 染色鏡檢

對(duì)采集的心血、肺臟、肝臟、脾臟組織涂片瑞氏染色鏡檢。從心血、肺臟涂片中發(fā)現(xiàn)單一的、兩極濃染的球桿菌，可見明顯的莢膜；心血涂片可見紅細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，中間出現(xiàn)空洞，紅細(xì)胞表面附著大量蟲體，呈鏈狀排列，紅細(xì)胞呈星形（圖2）。初步判定為，巴氏桿菌與附紅細(xì)胞體的混合感染。

圖2 病死牛血液涂片染色結(jié)果

2.3 細(xì)菌鑒定

將從肺臟組織中分離到的菌落進(jìn)行分離純化，經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定，發(fā)現(xiàn)生化反應(yīng)結(jié)果符合牛多殺性巴氏桿菌特性（可信度為99%），初步鑒定為牛多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）；對(duì)分離純化的菌落進(jìn)行PCR 特異性擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在460 bp 處均出現(xiàn)與目的片段一致的條帶（圖3），測(cè)序結(jié)果與GeneBank 數(shù)據(jù)庫中多殺性巴氏桿菌同源性達(dá)99%以上。

圖3 多殺性巴氏桿菌PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.4 支原體PCR 鑒定

將肺臟組織應(yīng)用PPLO 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，可觀察到煎荷包蛋樣菌落。典型菌落的特異性PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得了與預(yù)期大小一致的238 bp 片段（圖4），證明分離株為牛支原體；對(duì)陽性片段回收測(cè)序，發(fā)現(xiàn)分離株與牛支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45（GeneBank 號(hào)CP002188）、地方株FJ-HJ 株（GeneBank 號(hào)KX230478）、HB0801 株（GeneBank 號(hào)CP007591）、CQ-W70（GeneBank 號(hào)CP005933）16SrRNA 基因序列相似性介于96.9%～98.5%。

圖4 牛支原體分離株P(guān)CR 擴(kuò)增電泳圖

2.5 IBRV 和BVDV 的PCR 檢測(cè)

病牛血液BVDV、IBRV PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，未獲得目的條帶（圖5），檢測(cè)結(jié)果為陰性。

圖5 IBRV 和BVDV 的PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.6 藥敏試驗(yàn)

按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)和配套的試劑盒操作步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性：牛巴氏桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶敏感，牛支原體對(duì)左氧氟沙星、阿奇霉素敏感，兩種病原對(duì)臨床普遍使用的青霉素、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等表現(xiàn)出全部耐藥（表2）。

表2 牛巴氏桿菌和牛支原體藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 綜合診斷及治療

根據(jù)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果、病理解剖變化特征，結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)發(fā)病情況、臨床癥狀觀察，以及牛只經(jīng)長途運(yùn)輸?shù)那樾?，判定此次牛只發(fā)病死亡系由長途運(yùn)輸導(dǎo)致牛機(jī)體免疫力下降，擾亂了牛機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，繼而混合感染巴氏桿菌（多殺性巴氏桿菌）、牛支原體和附紅細(xì)胞體，引起急性敗血癥所致。對(duì)出現(xiàn)肺炎癥狀的發(fā)病牛只，按照抗菌消炎（結(jié)合市售獸藥情況，選用泰樂菌素和環(huán)丙沙星）、解熱鎮(zhèn)痛，配合強(qiáng)心補(bǔ)液，提高機(jī)體免疫力和抗過敏的原則進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)對(duì)處于發(fā)病期的牛治愈率不高，但對(duì)同群其余牛只治療效果較佳。經(jīng)過28 d的處理和治療，該牛群發(fā)病情況得到有效控制，沒有新發(fā)病例出現(xiàn)。

3 討論

為改善肉牛養(yǎng)殖品種，新疆建設(shè)兵團(tuán)部分農(nóng)牧團(tuán)場(chǎng)相繼從東北地區(qū)外購良種生產(chǎn)母牛，以解決肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢的現(xiàn)狀。此次大規(guī)模長距離外購生產(chǎn)母畜事件中，該場(chǎng)前期做了諸多準(zhǔn)備，包括實(shí)地考察、挑選牛只、聯(lián)系車輛、途中休息、飼養(yǎng)圈舍規(guī)劃、飼料儲(chǔ)備、技術(shù)人員安排等，但依然出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激綜合征，造成大量肉牛發(fā)病死亡，經(jīng)濟(jì)損失巨大。

近年來，牛肉需求量越來越大，導(dǎo)致許多地區(qū)肉牛供給不足，需要從外地經(jīng)長途運(yùn)輸引進(jìn)。而運(yùn)輸應(yīng)激綜合征嚴(yán)重影響了我國肉牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。動(dòng)物在運(yùn)輸過程中，遭遇驅(qū)趕、裝卸、震動(dòng)、擁擠、噪聲、溫濕度變化、禁水限食、疲勞等持續(xù)強(qiáng)烈的刺激后，會(huì)出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激綜合征，導(dǎo)致機(jī)體生理機(jī)能紊亂，抵抗力下降，此時(shí)病原微生物趁機(jī)侵入宿主體內(nèi)，會(huì)引起動(dòng)物發(fā)病死亡[7，10-12]。據(jù)國內(nèi)學(xué)者報(bào)道[2，13-15]：長途運(yùn)輸引發(fā)肉牛運(yùn)輸應(yīng)激綜合征的發(fā)病率約為80%，病死率達(dá)40%以上；在牛群轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，運(yùn)輸應(yīng)激常誘發(fā)以牛支原體肺炎為主的傳染性疾病，發(fā)病率在80%以上，病死率達(dá)10%以上，嚴(yán)重的甚至高達(dá)40%～60%，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

國外學(xué)者認(rèn)為：運(yùn)輸集裝箱卡車設(shè)計(jì)、儲(chǔ)存密度、駕駛員駕駛技術(shù)、道路質(zhì)量、通風(fēng)情況和環(huán)境溫度是評(píng)估運(yùn)輸條件時(shí)需要考慮的容易引起運(yùn)輸應(yīng)激綜合征的重要因素[16]；運(yùn)輸過程中發(fā)生的生理變化始于脫水、飼料攝入不足、組織損傷[17]、吸入煙霧[18-19]以及生理和心理壓力。國外學(xué)者已開展了運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)鼻咽部微生物群[20-21]、皮質(zhì)醇[22-23]、中性粒細(xì)胞[24-25]、機(jī)體免疫應(yīng)答[24，26-27]、急性期蛋白[23，28]以及基因表達(dá)[28-30]等多方面的影響。而國內(nèi)研究主要集中在病例分析[31-32]、生理指標(biāo)和生化免疫指標(biāo)[10，33]、對(duì)應(yīng)激蛋白與miRNA 的影響[34-37]、綜合防治和抗應(yīng)激處理技術(shù)[14，38-39]等方面。

Moore等[40]分析了2010—2012 年自澳大利亞運(yùn)往中東、俄羅斯和中國的20 次活牛長途運(yùn)輸中215 頭牛死亡的病因：最主要的是呼吸道疾?。?9.4%），其次是跛行（12.2%）、酮?。?.7%）、敗血癥（6.1%）和腸道疾?。?.6%）；2/3 的病牛肺組織有病變，其中72%發(fā)生細(xì)菌感染，3%發(fā)生病毒感染，22%發(fā)生細(xì)菌、病毒混合感染，3%原因不明；相關(guān)病毒主要是牛冠狀病毒、皰疹病毒Ⅰ型、病毒性腹瀉病毒、呼吸道合胞體病毒和副流感病毒3 型等，其他病原微生物主要有支原體、睡眠嗜組織菌、溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌等。

國內(nèi)研究[41-42]發(fā)現(xiàn)：肉牛運(yùn)輸應(yīng)激綜合征常表現(xiàn)為呼吸道疾病，其次為腹瀉和關(guān)節(jié)腫脹；感染病原主要為支原體和巴氏桿菌。姚永進(jìn)等[8]、楊銘偉等[9]在新疆石河子、博樂、奎屯、塔城等地區(qū)牛場(chǎng)因肺炎死亡的犢牛肺臟組織中，分離獲得牛支原體，但多數(shù)分離自犢奶牛及3月齡內(nèi)的乳用犢牛；張銳等[43]確診新疆北屯市某牛場(chǎng)新引進(jìn)肉犢牛發(fā)生肺炎死亡的病原為牛支原體，推測(cè)可能與牛群發(fā)病前的長途運(yùn)輸應(yīng)激有關(guān)，說明運(yùn)輸應(yīng)激不僅可誘發(fā)牛巴氏桿菌病，也可導(dǎo)致牛支原體肺炎暴發(fā)。由此可見，牛引種運(yùn)輸需要重點(diǎn)加強(qiáng)呼吸道疾病的管理與處置。

為降低運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)肉牛健康的影響，需要綜合考慮運(yùn)輸?shù)恼麄€(gè)過程和環(huán)節(jié)，如運(yùn)輸前根據(jù)牛群基本情況和自身需要挑選高品質(zhì)健康肉牛，不能從疫區(qū)引進(jìn)肉牛，有條件的可以進(jìn)行主要疫病的流行病學(xué)調(diào)查；引進(jìn)后加強(qiáng)飼養(yǎng)管理與保健，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力和體抗力，防止病原微生物入侵；提前改變飼喂方式，以適應(yīng)長距離運(yùn)輸需要，做好環(huán)境和車輛的消毒等。運(yùn)輸過程中需要注意車輛的選擇以及車速、路線規(guī)劃、中途休息與飼喂、裝車密度、運(yùn)輸時(shí)間和季節(jié)、安全防護(hù)與病牛治療等。到達(dá)目的地后要小群飼養(yǎng)，隔離觀察，做好過渡期的飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)需求，注意保持牛舍衛(wèi)生清潔、通風(fēng)和消毒，待動(dòng)物體況穩(wěn)定并進(jìn)行驅(qū)蟲后，再混群飼養(yǎng)。當(dāng)肉牛出現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激綜合征時(shí)，應(yīng)先隔離病牛，對(duì)污染的圈舍、墊料、用具和受威脅的牛群進(jìn)行消毒處理，同時(shí)進(jìn)行臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，查明發(fā)病原因，采取對(duì)因治療和對(duì)癥治療。建議推廣實(shí)施“自繁自養(yǎng)”模式，擴(kuò)大肉?；A(chǔ)母牛群，增加各地尤其是傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)地區(qū)能繁母牛的存欄量。

4 結(jié)論

通過現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，結(jié)合臨床癥狀、臨床剖解和發(fā)病情況，初步診斷此次大規(guī)模外購生產(chǎn)母畜到達(dá)目的地后發(fā)病死亡的原因是長途運(yùn)輸引起的應(yīng)激綜合征；經(jīng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)，確定引發(fā)應(yīng)激綜合征的主要致病菌為巴氏桿菌和支原體，并伴有附紅細(xì)胞體的混合感染；對(duì)癥治療、抗菌消炎、提高機(jī)體免疫力和抗過敏的治療原則，對(duì)發(fā)病中后期牛群的治療效果不佳，但對(duì)同群其余牛效果顯著。此病例的診治，為長途調(diào)運(yùn)生產(chǎn)母畜時(shí)，降低類似事件的發(fā)生提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。