高 珊 常玉梅 趙雪飛 3 孫 博 張立民 梁利群 董志國

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室,農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院特殊生境魚類種質(zhì)特性與抗逆育種重點實驗室,黑龍江 150070;2.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,連云港 222000;3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院,黑龍江 150040)

我國有4.6×105km2低洼鹽堿水域,具有高堿度、高pH、水質(zhì)類型復(fù)雜等特點,其中堿度常先于鹽度限制魚類的生存和繁衍,現(xiàn)絕大部分處于荒置狀態(tài)[1,2]。瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii),俗稱東北雅羅魚、華子魚、白魚,隸屬于鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科、雅羅魚屬,在我國黑龍江、遼河、黃河流域及內(nèi)陸鹽堿湖泊均有分布,具有極強的耐高堿特性,能夠耐受內(nèi)蒙古達(dá)里諾爾湖碳酸鹽堿度

(Carbonate alkalinity,CA)高達(dá)54 mmol/L,pH9.6的極端惡劣環(huán)境[3]。解析瓦氏雅羅魚耐高堿的生理和分子機制,培育耐高堿新品種,對推進(jìn)鹽堿水域的開發(fā)利用進(jìn)程具有重要的戰(zhàn)略意義。

鰓是魚類氣體交換、滲透壓調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運、氨氮排泄等重要生理過程發(fā)生的主要場所,其形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化直接影響魚類存活[4]。鰓是研究環(huán)境變化對魚類影響的代表性器官,其形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能隨著水體鹽度[5,6]、堿度[7]、pH[8]、溫度[9]等環(huán)境因子的變化而發(fā)生變化。因此,開展鰓的組織學(xué)調(diào)查是評估環(huán)境污染、魚病發(fā)生程度的重要研究手段[10,11]。

瓦氏雅羅魚作為耐堿魚類研究的模式生物,前期圍繞其耐高堿特性,已從生理生化、分子生物學(xué)、基因組學(xué)等方面開展了一系列研究,尤其借助于高通量測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)很多基因及通路在離子交換、滲透壓調(diào)節(jié)、酸堿平衡等生理過程發(fā)揮重要作用[12—15]。這些重要的生理活動與鰓的結(jié)構(gòu)與功能變化密不可分。本研究擬通過比較不同碳酸鹽堿度脅迫下,達(dá)里諾爾湖瓦氏雅羅魚(堿水種)和松花江瓦氏雅羅魚(淡水種)鰓組織結(jié)構(gòu)的微觀變化,探究達(dá)里諾爾湖瓦氏雅羅魚耐高堿特性與鰓組織結(jié)構(gòu)微觀調(diào)整的適應(yīng)性關(guān)系,為魚類耐鹽堿的生理和分子機制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗魚為內(nèi)蒙古達(dá)里諾爾湖瓦氏雅羅魚自交F2和松花江瓦氏雅羅魚自交F2,飼養(yǎng)于黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站。選擇大小一致,體質(zhì)量為(22.24±4.68) g的個體45尾,運回實驗室,在循環(huán)可控水族箱(42.6 cm×28.4 cm×29.3 cm)暫養(yǎng)7d。實驗用水為過濾、曝氣24h的自來水,水質(zhì)檢測指標(biāo)見表1。

1.2 不同NaHCO3堿度脅迫實驗

實驗設(shè)置對照組(CA0)、NaHCO3堿度30 mmol/L(CA30)、NaHCO3堿度50 mmol/L(CA50) 3組,每組3個重復(fù),每個重復(fù)5尾實驗魚。采用緩慢提升堿度的方法開展脅迫實驗。以5 mmol/(L·d)的速度緩慢提升,堿度至30和50 mmol/L 后維持該堿度22d,每天換水1/2,實驗期間不投喂,采用YSI多功能水質(zhì)分析儀監(jiān)測水質(zhì)溫度、pH、溶氧、鹽度、氨氮等指標(biāo),用酸堿滴定法測定水體堿度。不同堿度脅迫期間,各實驗組水體檢測指標(biāo)見表1。

表 1 對照組和實驗組水體檢測指標(biāo)Tab.1 Water index control group and experimental group

1.3 樣品采集及固定

在堿度脅迫實驗結(jié)束后,對照及兩個堿度處理組各取5尾實驗魚的鰓組織,于Bouin’s液固定(苦味酸飽和溶液+福爾馬林25 mL+冰醋酸5 mL) 24h后,轉(zhuǎn)移至70%酒精于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織切片及拍照觀察

首先從70%酒精中取出組織,參考楊建等[16]的方法,切成大小適中的組織塊,進(jìn)行脫水、透明和包埋。具體步驟如下: 50%酒精(12h)→70%酒精(過夜)→80%酒精(1h)→90%酒精(30min)→95%酒精(30min)→100%酒精Ⅰ(15min)→100%酒精Ⅱ(5min)→酒精、二甲苯(1∶1,30min)→二甲苯(15min)→二甲苯∶石蠟=1∶1(1h,烘箱)→包埋機(Leica EG1150)包埋。包埋后使用切片機(Microm HM 200)切成5 μm的薄片,在涂有蛋清甘油(1∶1)的載玻片上滴滿蒸餾水,并將切片展開。

然后進(jìn)行脫蠟、染色。具體步驟如下: 二甲苯(10min)→二甲苯、酒精(1∶1,5min)→100%酒精(5min)→85%酒精(5min)→80%酒精(5min)→蒸餾水沖洗(10min)→蘇木子染色(10min)→流水沖洗(15min)→鹽酸分化液(8s)→流水沖洗(15min)蒸餾水沖洗(1min)→伊紅復(fù)染(2min)→流水沖洗(15min,根據(jù)染色情況控制沖洗時間)→80%酒精(5min)→90%酒精(5min)→100%酒精Ⅰ(5min)→100%酒精Ⅱ(3min)→二甲苯、酒精(1∶1,2min)→二甲苯Ⅰ(5min)→二甲苯Ⅱ(5min)→中性樹膠封片、烘干。

最后采用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照(Olympus BX 53&DP74)。測微尺測定鰓呼吸面鰓絲寬度、鰓小片長度及鰓小片間距。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS13.0軟件對鰓絲主干寬度、鰓小片長度及鰓小片間距進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。采用Duncan法進(jìn)行組內(nèi)多重比較分析,采用t檢驗進(jìn)行組間差異比較分析。P＜0.05具有顯著差異,P＜0.01具有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 不同NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

組織切片結(jié)果顯示,在正常條件下(CA0),兩種實驗魚的鰓絲和鰓小片完整,鰓絲末端膨起呈棒狀,鰓小片垂直于鰓絲,呈柳葉狀向兩側(cè)伸展。細(xì)胞核小,染成藍(lán)紫色。在NaHCO3堿度脅迫下,兩種實驗魚的鰓絲寬度、鰓小片長度和鰓小片間距都發(fā)生了顯著變化(表1)。雅羅魚堿水種鰓小片無破損,而淡水種在CA30開始出現(xiàn)破損,CA50時破損面積增大(圖1)。

隨著堿度增加雅羅魚堿水種鰓組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著變化,鰓絲變寬、鰓小片變長、鰓小片間距變大(P＜0.05)。同樣地,隨著堿度增加,雅羅魚淡水種鰓組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著變化,鰓絲變寬、鰓小片間距變大(P＜0.05),鰓小片長度在CA30時顯著變長(P＜0.05),但在CA50時與對照組無明顯差異(表2)。

圖1 不同堿度對瓦氏雅羅魚堿水種和淡水鰓組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of bicarbonate alkalinity on the gill structure in alkali-adapted species and freshwater species of Amur ide

表 2 NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓結(jié)構(gòu)的影響Tab.2 Effect of NaHCO3 alkalinity on the gill structure of Amur ide (n=9)

在相同堿度脅迫下,與淡水種相比,雅羅魚堿水種鰓絲顯著變寬(P＜0.01),鰓小片長度在CA50時顯著變長(P＜0.01),鰓小片間距在CA30時顯著變大(P＜0.05,表2)。

2.2 不同NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓絲上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

鰓絲上皮由多層上皮細(xì)胞組成,包括扁平上皮細(xì)胞(Pavement cell,PVC)、氯細(xì)胞(Mitochondriarich cell,MRC)、黏液細(xì)胞(Mucous cell,MC)、柱細(xì)胞(Pillar cell,PC)等。由圖2可以看出,氯細(xì)胞(Mitochondria-rich cell,MRC)主要位于鰓小片基部,多為長柱形或卵圓形,體積膨大,蘇木精-伊紅染色(HE)著色較深;扁平上皮細(xì)胞呈薄鱗狀覆蓋于鰓小片上,與柱細(xì)胞、血細(xì)胞交替排列形成血管通道。

與對照組相比,瓦氏雅羅魚堿水種在CA30和CA50的氯細(xì)胞數(shù)量明顯增加,HE著色較深,CA50的細(xì)胞排列更加緊密,細(xì)胞核變大并且有疊加現(xiàn)象;扁平上皮細(xì)胞變大,細(xì)胞表面增厚。瓦氏雅羅魚淡水種,CA30的氯細(xì)胞明顯多于CA50;隨著堿度增加,鰓小片出現(xiàn)破損,扁平上皮細(xì)胞、柱細(xì)胞和血細(xì)胞融合、脫落現(xiàn)象嚴(yán)重 (圖2)。

圖2 不同堿度對瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種鰓表皮MRC和PVC細(xì)胞的影響Fig.2 Effects of bicarbonate alkalinity on the gill MRC and PVC in alkali-adapted species and freshwater species of Amur ide

2.3 不同NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓耙上皮黏液細(xì)胞的影響

在鰓耙(Gill raker,GR)上皮中發(fā)現(xiàn)了黏液細(xì)胞,呈透明狀 (Mucous cell,MC,圖3)。在正常條件下,黏液細(xì)胞呈近似圓的橢圓形,排列和大小不均勻;隨著堿度的增加,黏液細(xì)胞由大而稀疏變?yōu)樾《芗?并且分布均勻。CA30,黏液細(xì)胞呈長橢圓形,大小形狀相似,且大都排列在靠外的部位,排列緊密整齊;CA50,黏液細(xì)胞大小和形態(tài)與CA30相似,但排列更加整齊緊密。在相同堿度條件下,瓦氏雅羅魚堿水種的黏液細(xì)胞數(shù)量較淡水種多,而且排列更為整齊、密集(圖3)。

3 討論

3.1 NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

魚類鰓組織直接與外界水體接觸,對水體的物理和化學(xué)變化非常敏感。Haaparanta等[17]發(fā)現(xiàn)季節(jié)性溫度及水質(zhì)是導(dǎo)致鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要因素,其中影響程度最為嚴(yán)重的是水體pH。在本研究中,添加NaHCO3導(dǎo)致水體pH處于9.44—9.55,基本與達(dá)里諾爾湖的pH 9.6相近。通過脅迫實驗發(fā)現(xiàn),瓦氏雅羅魚堿水種鰓絲主干變寬,鰓小片變長,鰓小片間距變大(P＜0.05),這與花鱸(Lateolabrax japonicus)[18]、鯔(Mugil cephalus)[6]、星斑川鰈魚(Platichthys stellatus)[19]在鹽度脅迫下(pH 8.0)的鰓絲細(xì)胞收縮、鰓小片間距變大的研究結(jié)果稍有不同。由此可以看出,堿度與鹽度對魚類鰓組織結(jié)構(gòu)的影響明顯不同,即耐鹽堿魚類和海水魚類鰓組織可能具備不同的生理調(diào)節(jié)機制。

高堿度高pH是耐鹽堿魚類生存環(huán)境的主要特點,因而賦予了這些魚類一些特殊的生理適應(yīng)性機制。青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)為了適應(yīng)高鹽堿的生活習(xí)性,其鰓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)包括鰓耙和鰓絲都發(fā)生了適應(yīng)性改變[20—22]。本研究通過比較瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種在相同堿度處理條件下的鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),雅羅魚堿水種鰓絲主干顯著變寬(P＜0.01),鰓小片長度顯著變長(P＜0.01),鰓小片間距變大趨勢明顯(表2)。推測這種結(jié)構(gòu)上的適應(yīng)性變化,有利于增強瓦氏雅羅魚在堿度脅迫下的氣體擴散效率,機體攝氧量,以此促進(jìn)自身的新陳代謝[5]。另外,從組織結(jié)構(gòu)的完整性來看,隨著堿度的升高,瓦氏雅羅魚堿水種的鰓組織結(jié)構(gòu)較為完整,無脫落、破損的現(xiàn)象;而瓦氏雅羅魚淡水種隨著堿度升高,鰓絲和鰓小片均有一定程度的脫落,這與花鱸[18]、鯔[6]等在鹽度脅迫下鰓小片出現(xiàn)斷裂、脫落的現(xiàn)象相符。這些研究結(jié)果表明,瓦氏雅羅魚堿水種由于長期生活在高鹽堿高pH的環(huán)境中,其鰓組織結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了適應(yīng)性改變。

3.2 NaHCO3堿度對瓦氏雅羅魚鰓上皮細(xì)胞的影響

魚類鰓組織直接與外界水體接觸,覆蓋于鰓絲的表皮細(xì)胞對鰓生理功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。氯細(xì)胞在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、離子調(diào)節(jié)和滲透壓平衡方面發(fā)揮重要作用[23,24]。廣鹽性硬骨魚類可通過調(diào)節(jié)鰓絲上皮中氯細(xì)胞的數(shù)量、分布、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及Na+-K+-ATPase活性等來適應(yīng)外界的鹽度變化[25,26]。目前已經(jīng)在莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)、大西洋鮭(Salmo salar)等魚類中鑒定了多種氯細(xì)胞類型[27]。研究發(fā)現(xiàn),虹鱒(Oncorhynchus mykiss)鰓氯細(xì)胞數(shù)量與鹽度呈線性正相關(guān)[28]。Maina[29]在肯尼亞馬加迪湖(Lake Magadi,pH10)羅非魚(Oreochromis alacalicusgrahami)鰓上皮發(fā)現(xiàn)了2種氯細(xì)胞,其在不同環(huán)境刺激下的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、線粒體數(shù)量和大小存在顯著差異;張仁意等[22]觀察了青海湖裸鯉鰓氯細(xì)胞特征,發(fā)現(xiàn)其數(shù)量多于淡水型。本研究發(fā)現(xiàn),隨堿度升高,瓦氏雅羅魚堿水種鰓氯細(xì)胞數(shù)量增多、體積變大并且有疊加現(xiàn)象。這些研究表明耐鹽堿魚類的氯細(xì)胞數(shù)量和堿度也存在正相關(guān)。氯細(xì)胞主要位于鰓小片基部,鹽度或堿度脅迫,魚類氯細(xì)胞數(shù)量增多與鰓小片間距變大的研究結(jié)果也是相符的。

鰓小片較薄的表皮細(xì)胞有利于環(huán)境和血液的氣體交換和擴散,但在環(huán)境脅迫時因防御反應(yīng)會造成細(xì)胞隆起(Lifting up of the epithelium)和鰓小片融合(Lamellar fusion)現(xiàn)象,以避免損傷。細(xì)胞隆起會增加毒物進(jìn)入血液的距離,鰓小片融合則會減少脆弱鰓表面積的數(shù)量[30]。本研究在堿度脅迫下未發(fā)現(xiàn)鰓小片融合現(xiàn)象,但發(fā)現(xiàn)瓦氏雅羅魚堿水種鰓小片上的扁平上皮細(xì)胞變大增厚,而淡水種則出現(xiàn)細(xì)胞融合脫落現(xiàn)象(圖2),這與食蚊魚(Gambusia affinis)[30]、大菱鲆幼魚(Scophthalmus maximus)[31]、莫桑比克羅非魚[32]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[33]在pH、溴氰菊酯、Cd2＋脅迫時的研究結(jié)果相似,進(jìn)一步表明瓦氏雅羅魚堿水種可通過細(xì)胞隆起阻止HCO和pH進(jìn)入血液,保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能的完整性以適應(yīng)高堿環(huán)境,而淡水種由于細(xì)胞融合,結(jié)構(gòu)不完整造成生理功能喪失,因而不能適應(yīng)高堿環(huán)境。

黏液細(xì)胞的增加和分泌與魚類鹽度[34]、pH、氨濃度[35]的增加及病原微生物和寄生蟲感染[36]顯著相關(guān)。本研究通過比較瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種在不同堿度脅迫下鰓耙上皮黏液細(xì)胞數(shù)量、分布、形態(tài)等特征發(fā)現(xiàn),瓦氏雅羅魚堿水種隨著堿度增加,黏液細(xì)胞數(shù)量顯著增多、大小均勻、排列緊密,這與王瑞芳等[37]和Ouz[38]發(fā)現(xiàn)鹽堿湖泊瓦氏雅羅魚和卡拉白魚(Chalcalburnus tarichi)黏液細(xì)胞數(shù)量增多的研究結(jié)果相符,推測其數(shù)量增加可能在魚類滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。也有學(xué)者認(rèn)為黏液細(xì)胞的功能是分泌黏液,形成一個功能表面,促進(jìn)水的微循環(huán),利于氣體交換等其他作用[39]。

本研究通過比較瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種在不同堿度脅迫下鰓組織結(jié)構(gòu)的差異,發(fā)現(xiàn)堿水種由于長期適應(yīng)高堿環(huán)境,其鰓組織發(fā)生了適應(yīng)性變化: 鰓絲寬,鰓小片長,鰓小片間距大,覆蓋于鰓絲上皮的氯細(xì)胞和黏液細(xì)胞數(shù)量多,增強滲透壓和離子調(diào)節(jié)能力,扁平上皮細(xì)胞增厚,可有效阻止有毒物質(zhì)進(jìn)入血液,并和柱細(xì)胞保持鰓小片結(jié)構(gòu)的完整性,從而實現(xiàn)其在高堿環(huán)境下生理功能的正常發(fā)揮。