肖小年,劉悅珍,易孜成,章 輝,劉 璟,王 凡,易醒
(南昌大學a.中德聯(lián)合研究院;b.中德食品工程中心,江西 南昌 330047)
肉桂(Cinnamomumcassia)屬于樟科(Lauraceae)植物,是一種常用的藥食兩用原料。中國是世界上肉桂產(chǎn)量最大的國家,種植歷史已經(jīng)超過2000年,種植區(qū)域主要是廣東和廣西兩省[1-3]。肉桂油能夠發(fā)揮抗氧化、抗菌、抗癌等多種作用,因此在食品、衛(wèi)生、制劑、包裝、化妝品等領域中被廣泛地應用[4]。肉桂醛是肉桂油中的主要功效成分,含量高達90%,近些年來被學者們廣泛研究[5]??诜夤鹑┛梢源碳ひ葝u素的釋放并且改善胰島素敏感性,從而發(fā)揮降血糖的作用[6-9]。肉桂醛也可以通過刺激AMPK活化,促進脂肪酸氧化,阻止細胞分化和脂肪細胞形成[9-10]。此外,大量的研究也已證實,肉桂油對細菌和真菌都有很強的抑制作用[11-15]。肉桂油(Cinnamon Oil,CO)溶解度低、揮發(fā)性強,在加工、利用和貯存過程中易在空氣、光和加熱作用下分解[4],并且肉桂醛很容易在血液中轉化為肉桂酸,從而影響肉桂油發(fā)揮其藥理活性[16]。因此構建一種提高肉桂油水溶性和穩(wěn)定性的制劑是十分必要的。
微乳是一個由水、油和雙親性物質表面活性劑組成的熱力學穩(wěn)定的各向同性液體[17]。微乳不僅對難溶性及脂溶性的藥物具有增溶作用,還能夠提高藥物的穩(wěn)定性,因此在中醫(yī)藥中,用微乳作為制劑的應用越來越多[18]。制備肉桂油的O/W型微乳,是一種提高肉桂油的溶解性、穩(wěn)定性以及保持其功能性的有效的辦法。
目前,國內外對肉桂油的研究主要集中在提取、化學成分鑒定以及相關制劑的制備及質量評價[19-23],對于肉桂油微乳在體外釋放方面的研究報道相對較少。在本研究中,我們討論了表面活性劑和助表面活性劑的比例(Km)以及溫度對于O/W型肉桂油微乳(Cinnamon Oil Microemulsion,COME)形成的影響。從離心、冷熱循環(huán)和長期儲藏3個方面考察了肉桂油微乳的穩(wěn)定性。此外,還對肉桂油微乳在不同pH介質中的釋放動力學和機理進行了討論。
肉桂醛對照品≥99.5%,胃蛋白酶(酶活力1∶3000),胰酶,USP grade,阿拉丁試劑有限公司;肉桂油,吉安國光香料廠;甲醇,乙腈,色譜純,天津市永大化學試劑有限公司;肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、EL-40、Span 80、Tween 80、無水乙醇、丙三醇均為分析純。
DDS-307型電導率儀,上海精密科學儀器有限公司;WYA-2W型阿貝折射儀,上海精密科學儀器有限公司;PB-10型pH計,賽多利斯科學儀器有限公司;NICOMP380ZL型激光納米粒度測定儀,美國PSS粒度分析儀公司;JB-3型恒溫磁力攪拌器,上海雷磁新涇儀器有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。
1.3.1 肉桂油微乳的制備
把肉桂油和肉豆蔻酸異丙酯(IPM)按1∶1的比例加入燒杯中,攪拌均勻以后再依次加入Tween 80和丙三醇,把蒸餾水逐滴地加入正在磁力攪拌的預混料中。并且在開始加入蒸餾水后,把電導率儀放入燒杯里面,不斷觀察電導率的變化并記錄,當電導率出現(xiàn)最大值時,停止水相的加入,并且記錄下蒸餾水的用量。計算出油相、乳化劑和水相三相的質量分數(shù),并以此為基礎在偽三元相圖標記為點,這些點的覆蓋面積就是所形成的微乳區(qū)域面積(Microemulsion Area,ME)。在此基礎上,根據(jù)最大的微乳區(qū)域面積來選擇合適的組成和工藝條件。
1.3.2 表面活性劑和助表面活性劑的質量(Km)的選擇
據(jù)1.3.1的實驗步驟,在固定溫度下,選擇不同Km值(1∶1,2∶1,3∶1,4∶1,w/w)制備微乳并繪制偽三元相圖,選擇出合適的Km值。
1.3.3 溫度對肉桂油微乳制備的影響
分別于25℃,40℃,50℃的溫度下制備微乳,根據(jù)偽三元相圖微乳區(qū)域的大小來確定最佳溫度。
1.3.4 肉桂油微乳配方的優(yōu)化
CO/IPM(1∶1,w/w)作為混合油相,無水乙醇/丙三醇(1∶1,w/w)作為混合助表面活性劑,選擇Span 80和EL-40為表面活性劑分別與Tween 80進行復配,固定Km=4,在40℃下,根據(jù)1.3.1節(jié)的方法制備O/W型肉桂油微乳。
1.3.5 微乳的判別及類型鑒別
將制備的澄清體系在4 000r·min-1條件下離心20min,通過觀察是否出現(xiàn)分層或者沉淀,來判斷微乳的形成。在制得的微乳體系中加入紅色的油溶性染料蘇丹Ⅲ和藍色的水溶性染料亞甲基藍,觀察兩種染料在微乳中的擴散速度,判斷微乳的類型[24]。
1.3.6 COME理化參數(shù)的測定
利用NICOMP380ZL型激光納米粒度測定儀、DDS-307電導率儀以及WYA-2W型阿貝折射儀分別對肉桂油微乳的粒徑、平均分布、電導率和折光度進行測定。
1.3.7 肉桂油中肉桂醛的檢測[25]
液相色譜條件:色譜柱C18,5μm,4.6mm×250mm;流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(33∶67);柱溫25℃;進樣量20μL;流速1.0mL·min-1;檢測波長285nm。
工作曲線的制備:精密稱量0.020 0g肉桂醛對照品,用甲醇溶解后,轉移至25mL容量瓶中并定容,得到800μg·mL-1的肉桂醛儲備液。用甲醇將儲備液稀釋成系列質量濃度為20,40,60,80,100,120,140,160μg·mL-1的對照品溶液,取20 μL進樣,按照色譜條件檢測肉桂醛含量,每個濃度進樣3次,以肉桂醛對照品濃度(x)對峰面積(y)作圖,繪制標準曲線。
COME供試品溶液:精密稱取4.00g COME,加入一定質量的無水硫酸鈉,破乳后取上清液,用甲醇適當稀釋,過0.45μm微孔濾膜,得到COME供試品溶液。
1.3.8 肉桂油微乳穩(wěn)定性考察
分別通過離心試驗、加熱-冷卻循環(huán)實驗、貯藏試驗考察所制備的微乳配方的穩(wěn)定性。
1.3.9 體外釋放實驗
人工腸液的配制(SIF)[26-27]:精確稱量磷酸氫二鉀(KH2PO4)6.8g,加蒸餾水溶解,移至500mL容量瓶并用蒸餾水定容。用濃度為0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.8或者7.4;取胰酶10 g,加適量蒸餾水量溶解,將兩液混合均勻,移至1 000mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,即得pH 6.8和7.4的人工腸液。
三角瓶里面加入一定體積的SIF,以100 r·min-1的速度震蕩并且溫度保持在37℃±0.5℃。取20mL肉桂油微乳放入透析袋中,兩端用繩子扎緊后放進三角瓶里面。以固定的時間間隔從三角瓶中取樣,取樣后立刻向三角瓶中加入同體積的相同溫度的人工腸液。參照1.3.7的方法對樣品進行破乳并稀釋,測定肉桂醛含量,計算釋放液中肉桂醛含量??瞻兹橐旱尼尫沤橘|溶液同法處理。累積釋放速率用下式計算:
式中:Q為累積釋放百分數(shù)(%);V0為釋放介質溶液總體積(mL);V為取樣體積(mL);Ct為在釋放時間點測定的釋放介質溶液中肉桂醛的濃度(mg·mL-1);C為在前一個釋放時間點測定的釋放介質溶液中肉桂醛的濃度(mg·mL-1);W為被包封的肉桂醛的總質量(mg)。
數(shù)據(jù)采用Origin 7.5進行分析。
2.1.1 最佳Km值
通過比較偽三元相圖微乳區(qū)域大小來考察Km值(1∶1,2∶1,3∶1,4∶1,w/w)對微乳液制備的影響(圖1)。當Km=1時,只有部分比例可以形成微乳,構成的微乳區(qū)域最小。當Km值為2,3和4時,在8∶1~4∶1都可以形成微乳,且微乳面積隨著Km值的增加而增大。這有可能是因為助表面活性劑雖然可以降低界面張力,但是當助表面活性劑過量時,也相對地使表面活性劑的量減少了,從而乳化的能力也相應地降低,并且還會使混合膜的強度和穩(wěn)定性降低,因此不利于微乳的形成[28]。因此確定最佳Km為4。
2.1.2 乳化溫度的選擇
根據(jù)2.1.1的實驗結果,固定攪拌速度,考察乳化溫度(25℃,40℃,50℃)對肉桂油微乳液制備的影響(圖2)。隨實驗溫度的升高,ME先增加后減小。40℃的微乳區(qū)域面積最大,為最佳溫度。這可能是因為升高溫度可以加快分子的運動速度,能夠促進水油兩相與混合膜的相互作用,從而降低界面表面張力,更有利于形成微乳[29]。但是,當乳化溫度為50℃時,微乳制備過程中肉桂油的揮發(fā)不利于微乳的形成,因此形成的肉桂油微乳的面積變小。
2.1.3 肉桂油微乳配方的優(yōu)化
不同種類的表面活性劑的復合使用可以調節(jié)其HLB值,并且形成一種更為堅固的復合凝聚膜,從而增加微乳的穩(wěn)定性[30-31]。因此,選取Span 80或者EL-40分別與Tween 80進行復配,結果如表1。Tween 80/Span 80組合無法形成微乳,而Tween 80/EL-40組合都能夠形成澄清透明的體系,且經(jīng)過4 000r·min-1,20min離心后沒有出現(xiàn)相分離。
由2.1得出的最佳微乳制備條件為乳化溫度40℃,固定Km=4,所得最佳微乳配方為CO/IPM/Tween 80/EL 40/無水乙醇/丙三醇/水,其中CO/IPM=1∶1(w/w),Tween 80/EL-40=3∶1(w/w),無水乙醇/丙三醇=1∶1(w/w),蒸餾水含量為64.29%,肉桂油的最大含量為3.57%。將所制備的微乳在4 000r·min-1下離心20min,沒有出現(xiàn)相分離,初步表明所制備的乳液為微乳。如圖3,優(yōu)化以后的配方制備的乳液平均粒徑是14.6nm,多分布指數(shù)為0.111,進一步表明形成了微乳。
表1 Tween 80與不同種類表面活性劑復配形成的COME
在微乳液中滴加亞甲基藍和蘇丹紅染色液,比較擴散速度發(fā)現(xiàn),水溶性亞甲基藍的擴散速度快,說明制得的樣品為O/W型。O/W型、雙連續(xù)(BC)型和W/O型,這3種微乳可以在形成過程中通過電導率來區(qū)分[32]。所制備的微乳液電導率為228μs·cm-1,這是因為COME的連續(xù)相是水,電導率相對來說比較高。微乳的折光率(RI)為1.3829,接近水相的折射率,也進一步證明形成了O/W型肉桂油微乳。樣品離心后,沒有出現(xiàn)沉淀、乳化和相分離的現(xiàn)象,說明樣品具有較好的物理穩(wěn)定性,構建的微乳體系良好。
在1.3.7節(jié)色譜條件下,對肉桂醛對照品溶液和COME供試品溶液進行HPLC檢測,結果如圖4,肉桂醛保留時間為(16.700±0.200)min,所得線性回歸方程為y=162.7x+169,R2=0.998,表明肉桂醛濃度在20μg·mL-1~160μg·mL-1范圍內線性良好。經(jīng)計算,COME中肉桂醛含量為24.05mg·g-1。
2.4.1 離心穩(wěn)定性
以10 000r·min-1離心30min,微乳外觀依然澄清透明,沒有出現(xiàn)沉淀、乳化,說明制備的微乳離心穩(wěn)定性良好。
2.4.2 冷熱循環(huán)穩(wěn)定性
將肉桂油微乳在40℃的條件下放置12h,取出后再在4℃溫度下放置12h,作為1次加熱-冷卻循環(huán)。肉桂油微乳經(jīng)過5次加熱冷卻循環(huán)后,沒有發(fā)生破乳、聚結和相分離,依然保持著良好的穩(wěn)定性。
2.4.3 貯藏穩(wěn)定性
將制備的肉桂油裝入密閉的容器中,30℃±2℃下放置6個月,期間測定其理化性質、肉桂醛含量并目測微乳形態(tài),結果如圖5。0~6個月間,微乳體系pH略有下降,這可能是因為在儲藏過程中,微乳體系中的肉桂醛被氧化為肉桂酸,導致pH值變小。微乳體系的電導率呈先增大后減小的趨勢,在0~1個月間增加較大,1~6個月間變化較小。在貯藏過程中,微乳體系的折光率變化并不明顯。微乳中的肉桂醛含量在貯藏期間只稍微降低,6個月之后,微乳中肉桂醛的保留率高達92.79%。而同等條件下,普通肉桂油的保留率僅有46.52%。實驗結果說明,微乳體系可以成功地提高肉桂油的穩(wěn)定性。
從圖6可以看出,肉桂油微乳在pH 6.8和pH 7.4的人工腸液中的累計釋放率都隨著時間而增加。在8h時,肉桂油在pH 6.8的人工腸液中的釋放率達到了31.21%,而在pH 7.4中只有18.62%,說明不同的pH值對肉桂油微乳的體外釋放行為有影響。從釋放總量來看,到8h時,兩種介質中的釋放總量都不到一半,這說明還有釋放的可能,8h后的釋放情況還有待進一步研究。
繪制累積釋放率與時間的關系并用5個經(jīng)驗方程來擬合(圖6),分析肉桂油微乳在兩種不同釋放介質中的釋放動力學。在不同的pH條件下,由5個動力學方程分別得到R2(表2,3)。
通過比較R2值表明,在pH 6.8和pH 7.4SIF中,Retger-peppas方程的擬合都優(yōu)于其他4個動力學方程。這些結果顯示Retger-peppas方程適合COME的釋放擬合。
表2 COME在pH 6.8人工腸液中的釋放動力學模型建立結果
表3 COME在pH 7.4人工腸液中的釋放動力學模型建立結果
通過Retger-peppas方程,可以研究肉桂油釋放的機理和動力學。方程如下式:Q=k×tn
其中k是系統(tǒng)的動力學常數(shù),n是擴散指數(shù),是分析釋放速率機制的重要參數(shù)[33]。肉桂油微乳在兩種pH的人工腸液中的n值都介于0.45和0.85之間,表明肉桂油的釋放屬于非Fickian擴散機制,依賴于藥物擴散和聚合物松弛的共同作用,藥物釋放的過程加快,因此高于Fickian釋放[33-34]。k值與釋放速度動力學有關,k值越高,藥物的釋放速度越快[35]。
表4總結了肉桂油在pH 6.8和pH 7.4釋放的k值和n值。可以看出,在pH 6.8的人工腸液中,釋放的k值(8.663 58)大于7.4的人工腸液(3.868 59)。這說明肉桂油微乳在酸性環(huán)境中比在堿性環(huán)境中釋放的更快,這與累計釋放百分數(shù)Q的結果是一致的。
表4 pH 6.8和pH 7.4人工腸液中COME的擴散指數(shù)(n)和擴散常數(shù)(k)
本研究制備了O/W型肉桂油微乳,確定最佳配方為CO/IPM/Tween 80/EL 40/無水乙醇/丙三醇/水體系,其中 Tween 80/EL-40=3∶1(w/w),無水乙醇/丙三醇=1∶1(w/w),Km=4,最佳制備溫度為40℃,肉桂油含量為3.57%,經(jīng)染色法鑒定為O/W型微乳。結果表明,肉桂油微乳具有良好的離心穩(wěn)定性,冷熱循環(huán)穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性,在貯藏6個月以后,肉桂油微乳中肉桂醛的保留率較普通肉桂油提高了1倍,表明將肉桂油制成微乳是解決肉桂油易氧化、易揮發(fā)問題的有效方法。
體外釋放實驗及釋放動力學模型擬合方面的的結果表明,肉桂油在pH 6.8人工腸液中的釋放速率比pH 7.8人工腸液更快,兩種介質中的釋放動力學都與Retger-peppas方程擬合度最高,釋放機制屬于非Fickian釋放。全面地考察肉桂油微乳的生物利用度,有待于對肉桂油微乳的腸吸收情況做進一步研究。