陳丹 李媛媛 趙俊

宮頸癌是發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，高復(fù)發(fā)率以及高轉(zhuǎn)移性是宮頸癌預(yù)后不良的主要原因，嚴重威脅著女性的身體健康[1]。近年來，盡管宮頸癌手術(shù)以及放化療技術(shù)取得了很大的發(fā)展，但是中晚期宮頸癌患者預(yù)后仍然極差[2]。因此，進一步尋找宮頸癌發(fā)病的分子機制對于改善中晚期患者預(yù)后具有重大意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在腫瘤的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，如miRNA以及l(fā)ncRNA等[3-7]。微小RNA即miRNA，一類長鏈非編碼RNA，其長度為19～25個核苷酸[8]。miRNA主要通過結(jié)合靶基因的3’非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平從而干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細胞中亦存在較多差異表達的miRNA[10-13]，這些差異表達的miRNA可能成為宮頸癌分子靶向治療的潛在靶點。有研究報道m(xù)iR-17在乳腺癌以及肺癌中均出現(xiàn)差異表達，且差異表達的miR-17與腫瘤增殖密切相關(guān)[14,15]。miR-17在宮頸癌細胞中表達顯著降低[16]，但其在宮頸癌中的發(fā)病機制尚未完全闡明。Akt又名蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)，當前的研究結(jié)果表明AKT通路在細胞的增殖與凋亡過程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[17]。TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果表明Akt2為miR-17的靶向調(diào)控基因，因此我們猜測miR-17可以通過靶向調(diào)控Akt2/Foxo1A/Bcl-2通路抑制宮頸癌細胞的增殖。本研究以上述背景為基礎(chǔ)，以Hela細胞株為研究對象，證實miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系，并通過多種實驗驗證miR-17靶向調(diào)控Akt2從而促進宮頸癌細胞增殖。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年8～12月在我院行手術(shù)切除的宮頸癌患者手術(shù)標本23例，包括癌組織以及癌旁正常組織，入組患者均具有完善的病歷資料。納入標準：(1)初診患者，術(shù)前無放化療以及內(nèi)分泌治療史；(2)術(shù)后病理確診為宮頸癌患者。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌等其他惡性腫瘤病史；(2)無心功能以及肝腎功能障礙；(3)合并傳染病史如艾滋病、梅毒以及肝炎等。標本離體后30 min內(nèi)切取新鮮的癌組織以及癌旁正常組織，并將其置于裝有RNA保存液的凍存管中，放于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器 miR-17 mimics、inhibitor及對照組NC(普健生物科技有限公司，武漢)，蛋白酶抑制劑、PMSF(浩然生物技術(shù)有限公司，上海)，Trizol試劑(Thermo Fisher公司，美國)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)，DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰酶(Thermo Fisher公司，美國)，雙熒光素酶活性檢測試劑盒(北京艾然生物科技有限公司，北京)，Akt2抗體(abcom,ab38513)，內(nèi)參GAPDH抗體(abcom,ab8245)，Akt2的3’-UTR熒光素酶報告基因載體(introvigen公司，美國)，qT-PCR試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，RIPA組織裂解液(索萊寶科技有限公司，北京)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)，RNA提取試劑盒(索萊寶科技有限公司，北京)。宮頸癌細胞株(上海生命科學院細胞和生物化學研究所)。

1.3 細胞培養(yǎng) 液氮中取出Hela細胞以及正常宮頸上皮細胞，37℃快速復(fù)溫后離心(800 r/min，3 min)，將加入1 ml含有10%FBS的培養(yǎng)基重懸后將細胞轉(zhuǎn)移至25 cm2的小瓶中，繼續(xù)加入3 ml培養(yǎng)基，并將其置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育。SiHa以及Hela細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，H8細胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。

1.4 RNA提取及qRT-PCR檢測 (1)將收集的宮頸癌組織以及正常組織從-80℃冰箱取出并置于冰上，用鑷子或剪刀鉗夾適量組織塊置于研缽中，加入少許液氮后用力將組織研碎，加入1 ml Trizol反復(fù)吹吸，盡量將組織全部轉(zhuǎn)入無RNA酶的1.5 ml EP管中。加入200 μl氯仿，震蕩混勻后室溫靜置15 min，離心(12 000 g，4℃，15 min)，取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，離心(12 000 g，4℃，15 min)，加入75%乙醇，震蕩混勻后離心(8 000 g，4℃，5 min)，棄上清，室溫干燥15 min。10 μl DEPC水溶解RNA后，核酸檢測儀檢測RNA的濃度和純度(A260/280值約2.0)，將剩余的提取RNA立即放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)取融合度>80%的SiHa、Hela以及H8細胞消化后，離心，棄上清，提取細胞總RNA，以上述提取的總RNA為模板，進行實時定量PCR技術(shù)，循逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，擴增28～32個循環(huán)后在實時熒光定量系統(tǒng)上檢測各組的CT值并記錄。G3PD為內(nèi)參，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?取對數(shù)生長期的Hela細胞，熒光顯微鏡下玻璃板計數(shù)，取2×104個細胞接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度達80%時將Akt2的3’-UTR熒光素酶報告基因載體及對照組(NC)導(dǎo)入細胞，每組設(shè)3個平行孔，共分為4組：Akt2(野生型或突變型)與miR-17 mimics共轉(zhuǎn)染組；Akt2(野生型或突變型)與對照組共轉(zhuǎn)染組，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培基，PBS沖洗2次(PBS提前預(yù)冷)，每孔加入100 μl 1×passive lysis Buffer，孵育15 min(室溫)，96孔發(fā)光檢測板中加入待檢樣品，放入ModulusTM 發(fā)光檢測儀中讀數(shù)，計算相對熒光強度并進行統(tǒng)計學分析。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染 取0.25%胰酶消化融合度達80%左右的對數(shù)生長期細胞，將其制成單細胞懸液，接種于6孔板中，每孔1.5×105個細胞，將接種好細胞的6孔板搖勻后置于細胞培養(yǎng)箱中。8 h后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染：A：更換1.5 ml無血清培養(yǎng)基，取5 μl lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入250 μl無血清混勻，室溫靜置20 min；B：取適量待轉(zhuǎn)化合物加入至250 μl無血清培養(yǎng)基中；C：將A液與B液混勻后加入6孔板中。6 h后換成常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度達80%左右時，收集細胞。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.7 MTS檢測細胞 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，胰酶消化后將其制成單細胞懸液后計數(shù)，將細胞接種于以96孔板中(2×103個細胞)，每個轉(zhuǎn)染組細胞設(shè)6個復(fù)孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、1、2、3、4、5天各孔加入20 μl MTS工作液，培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，酶標儀測定490 nm波長處各組細胞的吸光度 (OD值)，重復(fù)3次實驗。

1.8 細胞克隆形成能力檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，胰酶消化后接種于6孔板中(每孔300個細胞、2 ml 培養(yǎng)基)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，各組孔重復(fù)加入轉(zhuǎn)染試劑一次，繼續(xù)培養(yǎng)1周，待觀察到有克隆團形成時，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，甲醇固定15 min，去固定液后加入Giemsa染液染色20 min，流水沖洗后晾干，掃描拍照，計數(shù)肉眼可見克隆團。重復(fù)3次實驗。

1.9 Foxo1A以及Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western-blot方法，收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，加入適量RIPA細胞裂解液裂解細胞(超聲破碎儀裂解30 min)；離心(14 000 g，4℃，30 min)，BCA 法測定細胞蛋白濃度，計算50 μg樣品的體積，加入總體積1/4的上樣緩沖液與樣品混勻后，將樣品置于沸水中煮沸5 min后將樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ淠z，上樣，跑膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，8%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜，TBST洗滌1次，二抗(1∶8 000)孵育2 h，TBST洗滌3次后，化學發(fā)光底物曝光條帶。GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 miR-17在宮頸癌組織以及細胞系中的表達 qRT-PCR檢測miR-17在宮頸癌組織與宮頸癌細胞株中的表達水平。結(jié)果顯示：miR-17在宮頸癌組織中的表達水平明顯低于周圍正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與正常宮頸上皮細胞H8相比，miR-17在宮頸癌細胞株SiHa以及Hela細胞中表達明顯低于正常宮頸上皮細胞H8，且在Hela中的表達最低；差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 miR-17在宮頸癌組織、正常組織和宮頸癌細胞系中的表達

表1 miR-17在癌組織以及宮頸正常組織的表達

表2 miR-17在宮頸癌及正常細胞系水平

2.2 qRT-PCR檢測細胞中miR-17的相對表達量 轉(zhuǎn)染miR-17 inhibitor、miR-17 mimics 以及對照組轉(zhuǎn)染細胞48 h后，收集細胞，RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，qRT-PCR檢測細胞內(nèi)miR-17的相對表達量，結(jié)果顯示：miR-17 inhibitor轉(zhuǎn)染細胞中miR-17 的相對表達量較NC組顯著降低，miR-17 mimics顯著高于NC，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明miR-17 inhibitor和mimics作用較強，可以繼續(xù)后續(xù)的功能實驗。見表3。

表3 不同處理條件下細胞內(nèi)miR-17的表達水平

2.3 miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系 TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果顯示miR-17與Akt2的3’-UTR區(qū)域存在互補結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示：Akt2-wt與miR-17 mimics共轉(zhuǎn)染組熒光素酶的活性明顯低于Akt2-wt與陰性對照組共轉(zhuǎn)染組；而Akt2-mut與miR-17 mimics以及陰性對照組間熒光素酶活性強度無顯著差異。Western Blot結(jié)果顯示，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組的Akt2蛋白表達水平較對照組均顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-17 inhibitor組Akt2蛋白的表達升高。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組的Akt2 mRNA表達水平較對照組顯著降低。差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系

2.4 MTS檢測細胞增殖 過表達或抑制miR-17的表達后，采用MTS法測定miR-17抑制劑組、過表達組和對照組細胞的增殖能力，結(jié)果顯示從第1天開始，與對照組相比，miR-17抑制物組細胞生長速度明顯加快，miR-7 mimics組細胞生長速度明顯減慢，且2組均隨時間的推移，活細胞數(shù)與對照組的差值有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 MTS檢測轉(zhuǎn)染Hela細胞miR-17抑制劑和mimics后1～5 d細胞增殖活性的變化;與對照組比較，*P<0.05

表4 不同處理條件下細胞增殖活性比較

2.5 細胞克隆形成能力的檢測 過表達或抑制miR-17的表達后，采用平板克隆實驗測定miR-17抑制劑組、過表達組和對照組細胞的克隆形成能力，結(jié)果顯示與對照組相比，miR-17抑制物組細胞克隆形成能力明顯增強，miR-7 mimics組細胞克隆形成能力明顯減弱(P<0.05)。見表5。

表5 不同處理條件下細胞克隆形成能力比較

2.6 流式細胞術(shù)檢測miR-17對宮頸癌細胞凋亡的影響 分別轉(zhuǎn)染miR-17 mimics ，抑制劑后，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的Hela細胞其凋亡率為(1.34±0.25)%，較對照組(4.67±0.41)%顯著降低；轉(zhuǎn)染miR-17 mimics的細胞其凋亡率(12.36±1.23)%，較對照組顯著升高。見圖5，表6。

2.7 3組細胞Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白表達水平比較 為了進一步闡明miR-17對Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白表達的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-17 mimics和miR-17抑制物48 h后，收集細胞，Western-blot檢測各組細胞中Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白的表達水平，結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17抑制物的Hela細胞Akt2表達顯著升高、FOXO1A以及Bcl-2表達顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-17 mimics組細胞Akt2表達顯著降低、FOXO1A以及Bcl-2表達顯著升高。見圖6，表7。

圖5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑后，較對照組相比，細胞凋亡數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-17 mimics后，較對照組相比，細胞凋亡率顯著升高(*P<0.05)

表6 不同處理條件下細胞凋亡率比較

3 討論

近年來，隨著社會的不斷進步，醫(yī)學進入了高速發(fā)展時代，基因檢測技術(shù)的不斷更新、靶向治療以及內(nèi)分泌治療的不斷改善，使得宮頸癌治療向著精準化治療方向邁進，然而，對于中晚期宮頸癌患者來說，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然較高，預(yù)后不良。目前研究已經(jīng)證實異常表達的分子或蛋白可能在促使腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。研究報道m(xù)iRNA的表達異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，包括肺癌、乳腺癌以及肝癌等[18-20]。因此，深入研究miRNA的功能及機制可能為腫瘤診斷、預(yù)后以及靶向治療等提供潛在靶標。

圖6 Hela細胞轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑以及miR-17 mimics 后，Akt2、FOXO1A以及Bcl-2蛋白表達變化。轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑后，western-blot檢測各組Akt2表達升高，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2蛋白表達顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-17 mimics后細胞中Akt2表達降低，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2蛋白表達顯著升高

表7 不同處理條件下細胞Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白表達水平比較

miR-17是miRNA家族中的一個成員，Liu等[21]發(fā)現(xiàn)miR-17在肝癌中的表達顯著下調(diào)，Xu等[22]發(fā)現(xiàn)miR-17表達下調(diào)可以顯著增強前列腺癌細胞對放療的敏感性，令人關(guān)注的是Li等[23]發(fā)現(xiàn)miR-17可通過靶向調(diào)控ETV1抑制三陰乳腺癌細胞增殖。而最近研究也發(fā)現(xiàn)miR-17在宮頸癌中的表達顯著降低，且與宮頸癌細胞增殖密切相關(guān)[24]，但具體機制尚未完全闡明。Akt2是PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在細胞增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。FOXO1A基因是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的重要一員，是PI3K/Akt通路下游的靶向調(diào)節(jié)因子，在細胞凋亡中起著重要作用[25]。B淋巴細胞白血病-2(B-cell lymphorma-2,Bcl-2)是目前已知重要的抗凋亡基因，同時也是FOXO1A下游的調(diào)節(jié)因子[26]，Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Akt2為miR-17的靶基因，因此本研究提出了miR-17通過靶向調(diào)控Akt2進而調(diào)控FOXO1A/Bcl-2通路干預(yù)細胞的增殖。本研究驗證了miR-17在宮頸癌組織與癌旁組織，宮頸癌細胞株Hela和宮頸正常上皮細胞株H8中的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-17在宮頸癌組織中表達顯著低于癌旁正常組織，且在宮頸癌細胞株Hela中的表達亦顯著低于正常宮頸上皮細胞株H8；進一步采用miR-17抑制劑和mimics轉(zhuǎn)染Hela細胞進一步研究miR-17在宮頸癌細胞增殖中發(fā)揮的作用，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的Hela細胞中miR-17表達明顯降低，MTS以及平板克隆實驗顯示細胞的增殖能力和平板克隆形成能力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；反之，轉(zhuǎn)染miR-17 mimics細胞中miR-17表達明顯增多，MTS以及平板克隆實驗顯示細胞的增殖能力和平板克隆形成能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；上述結(jié)果提示低表達的miR-17促進宮頸癌細胞增殖。

為了進一步研究miR-17在抑制宮頸癌細胞增殖中的作用機制，我們采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示，較對照組相比，野生型Akt2與miR-17共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低，由此可見，Akt2為miR-17的靶基因。此外，western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑組的Hela細胞Akt2蛋白表達升高，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達顯著降低，反之，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組Akt2蛋白表達降低，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達顯著升高。由此提示，miR-17可通過靶向Akt2調(diào)控FOXO1A/Bcl-2通路抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，miR-17在宮頸癌組織以及宮頸癌細胞株中的表達均顯著降低，且Akt2是miR-17的靶基因。miR-17抑制劑處理組細胞Akt2蛋白表達升高，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達顯著降低，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組Akt2蛋白表達降低，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達顯著升高。因此，miR-17可能是抑制宮頸癌細胞增殖的潛在靶向分子，為中晚期宮頸癌患者治療提供新的思路。