史夢琳 吳瑋琪 羅昊 余進(jìn)海 廖洪斐

脈絡(luò)膜黑色素瘤是成年人眼內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，該腫瘤早期癥狀不明顯，易漏診、誤診，且惡性程度高、易全身轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危及患者生命[1]。Maniotis等[2]發(fā)現(xiàn)，人葡萄膜惡性黑色素瘤中存在除腫瘤血管生成這一經(jīng)典途徑以外的腫瘤血供方式——血管生成擬態(tài)，即具有侵襲性的葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞可以在無血管內(nèi)皮細(xì)胞參與的情況下，通過自身變形和基質(zhì)重塑形成由細(xì)胞外基質(zhì)界定的微循環(huán)血供管道，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[3]。因此，僅針對內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成藥物，往往對存在血管生成擬態(tài)的腫瘤治療效果不佳，尋找抑制血管生成擬態(tài)形成的藥物，對腫瘤的治療具有重要意義。

木犀草素又名黃色黃素、黃示靈，化學(xué)名為3’，4’，5，7-四羥基黃酮，為天然黃酮類化合物。既往大量研究表明，木犀草素具有抗炎、保護(hù)心血管、抗腫瘤等多種藥理作用[4-6]。近期又有研究顯示，在胃癌中，木犀草素通過Notch1-血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路抑制腫瘤的血管生成和血管生成擬態(tài)形成[7]；在小鼠皮膚黑色素瘤模型中，木犀草素可以降低黑素瘤血管生成擬態(tài)相關(guān)標(biāo)志物(VEGF受體1、VEFG受體2、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9)的表達(dá)水平，有效抑制了血管生成擬態(tài)的形成[8]。然而，木犀草素是否對脈絡(luò)膜黑色素瘤具有抗血管生成擬態(tài)作用，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬對人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株C918進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，初步探討木犀草素對C918細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料木犀草素(批號：MUST-18102605，HPLC≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司；人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株C918購自深圳豪地華拓生物技術(shù)有限公司，經(jīng)STR鑒定合格；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)為以色列BI血清；RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS均購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉素均購自武漢博士德生物科技有限公司；二甲基亞砜購自瑞士Roche公司；CCK-8試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Matrigel購自美國Corning公司；糖原PAS染色液(細(xì)胞專用)購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；SDS裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑混合物、蛋白磷酸酶抑制劑混合物購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；p-PI3K、AKT、p-AKT抗體均購自美國CST公司；GAPDH抗體購自美國Proteintech公司；PVDF膜購自美國Promega公司；ECL免疫印跡(Western blot)檢測試劑盒購自美國Advansta公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)C918細(xì)胞使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2～3 d 以18傳代1次。

1.3 藥物配制及實(shí)驗(yàn)分組木犀草素用DMSO溶解成100.00 mmol·L-1的母液，放于-20 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋木犀草素母液至相應(yīng)濃度。實(shí)驗(yàn)分為對照組(木犀草素0 μmol·L-1組)、木犀草素12.50 μmol·L-1組、木犀草素25.00 μmol·L-1組、木犀草素50.00 μmol·L-1組。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力消化并重懸處于對數(shù)生長期的C918細(xì)胞，以每孔10×103個接種于96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS浸洗2次，分別加入含木犀草素0 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、6.25 μmol·L-1、12.50 μmol·L-1、25.00 μmol·L-1、50.00 μmol·L-1、100.00 μmol·L-1、200.00 μmol·L-1、400.00 μmol·L-1的培養(yǎng)基100 μL，每組均設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)12 h、24 h后各孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm波長處的光密度值(D值)，通過GraphPad Prism軟件擬合量效曲線。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)C918細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到95%以上時(shí)，用含體積分?jǐn)?shù)0.1%FBS培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)3 h，用細(xì)胞刮比著直尺在培養(yǎng)皿中劃痕，劃痕寬度約120 μm，PBS浸洗2遍后，分組處理細(xì)胞，更換為含體積分?jǐn)?shù)0.1%FBS的培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，再次顯微鏡下拍照，計(jì)算各組細(xì)胞的遷移速率。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前1 d，將Matrigel從-20 ℃取出放在冰盒里，于4 ℃冰箱中過夜融化。融化后的Matrigel用4 ℃預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)基行13稀釋。用鑷子將Transwell小室夾放于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取60 μL稀釋后的Matrigel沿著Transwell小室側(cè)壁緩慢滴加避免氣泡產(chǎn)生，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中6 h以凝膠。分組處理細(xì)胞后以相同密度將150 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后取出小室，輕輕甩干小室中的培養(yǎng)液，用細(xì)胞固定液固定C918細(xì)胞30 min，再用棉簽擦去Transwell小室上層未穿膜的細(xì)胞，2 g·L-1結(jié)晶紫溶液染色5 min，PBS清洗數(shù)次，晾干，放于載玻片上，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)各組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 C918細(xì)胞體外三維培養(yǎng)及糖原PAS染色將預(yù)先4 ℃過夜融化的Matrigel以每孔60 μL加入到96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中凝固2 h。消化處于對數(shù)生長期的C918細(xì)胞，分組處理后調(diào)整細(xì)胞密度為500×103個·mL-1，然后沿著孔壁慢慢加入200 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后顯微鏡下觀察成管情況并拍照計(jì)數(shù)。

將上述培養(yǎng)5 h后的細(xì)胞行糖原PAS染色。輕輕甩去96孔板中的培養(yǎng)液，PAS固定液固定15 min；水洗2次，加入氧化劑，室溫氧化15 min；水洗2次，加入Schiff Reagent，置于暗處浸染15 min；亞硫酸鈉滴洗2次，每次2 min；水洗2次，加入Mayer蘇木素染色液復(fù)染1 min；水洗，顯微鏡下計(jì)數(shù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)。

1.8 Western blot檢測血管生成擬態(tài)相關(guān)蛋白的表達(dá)收集木犀草素處理5 h后的各組C918細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的SDS裂解液裂解抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。制備80 g·L-1SDS-PAGE膠，每孔加入30 μg蛋白質(zhì)樣品。調(diào)節(jié)電壓為80 V，當(dāng)樣品通過濃縮膠進(jìn)入分離膠界面時(shí)，電壓調(diào)為110 V，直至溴酚藍(lán)于膠底部結(jié)束電泳；濕法電轉(zhuǎn)2 h；50 g·L-1BSA封閉液封閉1 h；分別加入兔抗人p-PI3K P85抗體(11000)、兔抗人AKT抗體(11000)、兔抗人p-AKT抗體(11000)、鼠抗人GAPDH抗體(15000)；搖床4 ℃孵育過夜；TBST漂洗4次，每次10 min；加入相應(yīng)二抗(15000)，搖床常溫孵育1 h；TBST漂洗4次，每次10 min；滴加ECL發(fā)光液，用成像系統(tǒng)顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Excel及GraphPad Prism軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素對C918細(xì)胞活力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，木犀草素以劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制C918細(xì)胞活力。通過GraphPad Prism軟件擬合量效曲線，確定木犀草素作用C918細(xì)胞12 h、24 h后，其IC50值分別為163.70 μmol·L-1和51.46 μmol·L-1。由此，預(yù)設(shè)0～50.00 μmol·L-1作為后續(xù)遷移、侵襲、血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度分組范圍。見圖1。

圖1 不同濃度木犀草素對C918細(xì)胞活力的影響 A：木犀草素作用C918細(xì)胞12 h；B:木犀草素作用C918細(xì)胞24 h

2.2 木犀草素抑制C918細(xì)胞遷移細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、木犀草素12.50 μmol·L-1組、木犀草素25.00 μmol·L-1組、木犀草素50.00 μmol·L-1組C918細(xì)胞的遷移速率分別為(24.89±0.46)μm·h-1、(9.87±1.24) μm·h-1、(9.11±0.85) μm·h-1、(6.41±0.92)μm·h-1。各濃度木犀草素組細(xì)胞遷移速率均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)；木犀草素12.50 μmol·L-1組、木犀草素25.00 μmol·L-1組與木犀草素 50.00 μmol·L-1相比，細(xì)胞遷移速率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；木犀草素12.50 μmol·L-1組與木犀草素25.00 μmol·L-1組相比，細(xì)胞遷移速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明，木犀草素有抑制C918細(xì)胞遷移的作用，且木犀草素50.00 μmol·L-1組作用效果最明顯。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

2.3 木犀草素抑制C918細(xì)胞侵襲Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，對照組、木犀草素12.50 μmol·L-1組、木犀草素25.00 μmol·L-1組、木犀草素50.00 μmol·L-1組的C918細(xì)胞穿過上室的每200倍視野細(xì)胞數(shù)分別為(69±8)個、(14±4)個、(6±3)個和(3±1)個。各濃度木犀草素組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)；木犀草素12.50 μmol·L-1組與木犀草素25.00 μmol·L-1組、木犀草素50.00 μmol·L-1組相比，細(xì)胞侵襲能力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；木犀草素25.00 μmol·L-1組與木犀草素50.00 μmol·L-1組相比，細(xì)胞侵襲能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明木犀草素能抑制C918細(xì)胞侵襲。見圖3。

圖3 各組Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A：對照組；B：木犀草素12.50 μmol·L-1組；C：木犀草素25.00 μmol·L-1組；D：木犀草素50.00 μmol·L-1組(×200)

2.4 木犀草素減少C918細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成顯微鏡下可見，對照組和木犀草素12.50 μmol·L-1組的C918細(xì)胞黏附于Matrigel表面，并自身變形、彼此連接，圍成網(wǎng)格樣、環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對照組糖原PAS染色呈陽性，提示環(huán)狀結(jié)構(gòu)是由脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞構(gòu)成，即血管生成擬態(tài)形成。對照組和木犀草素12.50 μmol·L-1組形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)分別為每孔(87±4)個和(77±6)個，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而木犀草素25.00 μmol·L-1組和木犀草素50.00 μmol·L-1組僅有部分細(xì)胞形成樹枝樣結(jié)構(gòu)，而無明顯環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成，說明當(dāng)木犀草素濃度大于25.00 μmol·L-1時(shí)，C918細(xì)胞株血管生成擬態(tài)形成受到抑制。見圖4。

圖4 顯微鏡下觀察各組C918細(xì)胞血管生成擬態(tài) A：對照組，形成網(wǎng)格樣、環(huán)狀結(jié)構(gòu)(×100),行PAS染色呈陽性(×400)； B：木犀草素12.50 μmol·L-1組，形成了網(wǎng)格樣、環(huán)狀結(jié)構(gòu)(×100)； C、D：木犀草素25.00 μmol·L-1組和木犀草素50.00 μmol·L-1組，僅有部分細(xì)胞形成樹枝樣結(jié)構(gòu)，無明顯環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成(×100)

2.5 木犀草素對C918細(xì)胞各蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、木犀草素12.50 μmol·L-1組、木犀草素25.00 μmol·L-1組、木犀草素50.00 μmol·L-1組各蛋白相對表達(dá)量間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。隨著木犀草素濃度增高，p-PI3K P85、p-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)，AKT蛋白表達(dá)不變，p-AKT與AKT比值減小。見圖5。

圖5 Western blot檢測各組C918細(xì)胞血管生成擬態(tài)相關(guān)蛋白的表達(dá) 1:對照組;2:木犀草素12.50 μmol·L-1組;3:木犀草素25.00 μmol·L-1組;4:木犀草素50.00 μmol·L-1組。與對照組相比，*P<0.05；與木犀草素12.50 μmol·L-1組相比，#P<0.05；與木犀草素25.00 μmol·L-1組相比，△P<0.05

3 討論

脈絡(luò)膜黑色素瘤是眼內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其惡性程度高、轉(zhuǎn)移快[1]。導(dǎo)致脈絡(luò)膜黑色素瘤患者死亡的最主要原因是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移，而腫瘤血管生成是其浸潤、轉(zhuǎn)移的重要一環(huán)[9]。傳統(tǒng)抗腫瘤血管生成的藥物主要是針對內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，而對抑制腫瘤細(xì)胞自身血管生成擬態(tài)效果不佳。在具有血管生成擬態(tài)的實(shí)體腫瘤中，抗內(nèi)皮細(xì)胞血管生成治療所導(dǎo)致的低氧環(huán)境反而可能促進(jìn)血管生成擬態(tài)的形成，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。

血管生成擬態(tài)是指腫瘤細(xì)胞通過自身變形并與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用形成管道結(jié)構(gòu)，此管道結(jié)構(gòu)具有“內(nèi)皮細(xì)胞”和“腫瘤細(xì)胞”的雙重特性，給腫瘤供血，促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移。目前，在多種惡性實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象的存在，血管生成擬態(tài)的管壁呈PAS染色陽性，而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如CD34染色則呈陰性，因此PAS-CD34雙染常作為體外血管生成擬態(tài)的檢測方法。除此以外，腫瘤細(xì)胞與Matrigel或Ⅰ型鼠尾膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分所構(gòu)建的三維體外培養(yǎng)模型也常作為體外血管生成擬態(tài)的檢測方法，如果腫瘤細(xì)胞在Matrigel或Ⅰ型鼠尾膠原蛋白中形成網(wǎng)狀分支，則提示血管生成擬態(tài)的形成[11-12]。另外，還有報(bào)道顯示，X射線顯微斷層攝影3D重建方法對是否有血管生成擬態(tài)形成也有提示作用[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素對C918細(xì)胞活力的抑制具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，考慮到木犀草素濃度過高可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，因此，根據(jù)12 h和24 h的IC50值，確定0～50.00 μmol·L-1木犀草素作為后續(xù)遷移、侵襲、血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度范圍。

腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的降解和遷移、侵襲是血管生成擬態(tài)形成的重要環(huán)節(jié)。本研究我們發(fā)現(xiàn)，木犀草素能顯著抑制人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株C918的遷移和侵襲。運(yùn)用Matrigel所構(gòu)建的三維培養(yǎng)C918細(xì)胞模型中，觀察到C918細(xì)胞能在體外形成血管生成擬態(tài)，而高于25.00 μmol·L-1木犀草素對血管生成擬態(tài)的形成有明顯抑制作用。Western blot檢測結(jié)果顯示，木犀草素會抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路磷酸化。PI3K/AKT信號通路廣泛存在于細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種生命活動中，是近年來發(fā)現(xiàn)的重要細(xì)胞內(nèi)中心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。有研究表明，CXCL8通過PI3K/AKT信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U87MG 和 U251血管生成擬態(tài)形成；EGFR通過PI3K/AKT信號通路抑制人膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成[14-15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素是通過PI3K抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株OCM-1血管生成擬態(tài)形成，且推測PI3K為脈絡(luò)膜黑色素瘤血管生成擬態(tài)形成通路中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞分子[12]。由此我們推測，PI3K/AKT信號通路在木犀草素抑制的人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株C918血管生成擬態(tài)中可能也起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。

綜上，本研究為腫瘤抗血管生成治療提供新的思路，同時(shí)也存在不足，此次研究我們未進(jìn)行PI3K/AKT通路中明星分子的回復(fù)實(shí)驗(yàn)；且僅進(jìn)行了木犀草素對C918細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，而木犀草素是否在其他存在血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞株和相關(guān)動物模型中也有抑制血管生成擬態(tài)作用，尚需進(jìn)一步研究。