唐陽(yáng)芳,陳 蕊,張少華

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:68626817@qq.com)

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于乳腺癌、直腸癌。全世界每年約有50萬(wàn)初發(fā)宮頸癌患者,中國(guó)每年新發(fā)病例約13萬(wàn),成為女性患者主要死因之一[1,2]。宮頸癌治療以手術(shù)及放化療為主,但由于化療藥物的神經(jīng)毒性、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、脫發(fā)等毒副反應(yīng)及耐藥等問(wèn)題,使其臨床應(yīng)用受到了一定限制[3,4],急需尋找新的治療手段。近年來(lái),在各種抗腫瘤藥物中,天然植物抗腫瘤藥物因其低毒性、高利用度等特點(diǎn)已受到了醫(yī)藥學(xué)界的高度重視[5]。槲皮素是廣泛存在于多種植物中的多醇羥基黃酮類(lèi)化合物,研究證實(shí)其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[6]。目前研究表明,槲皮素具有抗宮頸癌作用,可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡、抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等[7,8],但作用機(jī)制尚不完全明確。氧化應(yīng)激與宮頸癌等惡行腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9],也被作為宮頸癌的治療靶點(diǎn)[10]。本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)象,觀察槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及遷移的影響,探討氧化應(yīng)激在其中的作用,為初步探索槲皮素在宮頸癌中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

槲皮素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),用DMSO超聲裂解槲皮素溶解,配成不同質(zhì)量濃度的溶液,用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾,滅菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?0%胎牛血清、0.25%胰酶、DMEM(美國(guó)Gibco公司),細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),Transwell遷移小室(美國(guó)BD公司),細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

常規(guī)復(fù)蘇HeLa細(xì)胞,將細(xì)胞移到含有5 ml DMEM培養(yǎng)基的離心管中,室溫1 200 r/min離心3 min,棄上清。用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)懸浮細(xì)胞,接種到培養(yǎng)皿中,輕輕吹打混勻,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2-3 d傳代換液1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,按照每孔5×105個(gè)將細(xì)胞均勻的接種到6孔板中,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜。加不同濃度槲皮素(0,20,40,80 μmol/L)處理48 h,不加槲皮素組(0 μmol/L)設(shè)為對(duì)照組。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞,終止消化后收集細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加PBS重懸。用PBS將細(xì)胞潤(rùn)洗2次,1 500 r/min離心5 min。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行:加入500 μl Binding Buffer,重懸細(xì)胞;5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后加入5 μl PI,混勻;室溫避光反應(yīng)15 min(同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照,即正常細(xì)胞不加Annexin和PI);流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移

取上述處理48 h的細(xì)胞,0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞,室溫1 200 r/min離心3 min,去上清,PBS潤(rùn)洗2次,清洗掉殘余血清。無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2×105/ml,備用。在24孔板中加入800 μl 10%FBS培養(yǎng)基(含雙抗),并放入Transwell小室,在Transwell上室分別接入200 μl各組細(xì)胞懸液,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)48 h。取出Transwell,PBS小心清洗小室1次,70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h。0.5%結(jié)晶紫染液染色,室溫放置20 min,PBS清洗后用干凈棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)未遷移的細(xì)胞擦凈,然后顯微鏡觀察拍照,計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.5 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,去上清,加PBS重懸。用PBS將細(xì)胞潤(rùn)洗2次,1 500 r/min離心5 min。按照DCFH-DA細(xì)胞ROS檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行:向細(xì)胞沉淀中加入稀釋好的DCFH 1 ml;37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min,每隔3 min混勻1次;用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DCFH-DA熒光強(qiáng)度。

1.6 MDA含量檢測(cè)

樣品前處理:HeLa細(xì)胞置于EP管中,加入一定量的低滲溶液或雙蒸水,直接放入液氮3-5 s,立即提出轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱(20-30 s),再取出室溫解凍,解凍后按上述步驟重復(fù)3次,即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融。將勻漿液于5 000 r/min離心5 min,取上清待用。按照MDA測(cè)試試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行,漩渦混勻器混勻,試管口用保鮮膜扎緊,用針頭刺一個(gè)小孔,95 ℃水浴40 min,取出后流水冷卻,然后3 500 r/min離心10 min。取上清測(cè)532 nm處吸光值OD,計(jì)算細(xì)胞MDA含量。MDA含量(nmol/mg)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/L)/待測(cè)樣本蛋白濃度(mg/ml)。

1.7 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力檢測(cè)

樣品前處理同1.6,按照T-SOD測(cè)試盒進(jìn)行操作,混勻,室溫放置10 min,于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值OD?？係OD活力(U/mg)=(對(duì)照OD-測(cè)定OD)/對(duì)照OD/0.5×(反應(yīng)液總體積/取樣量)/蛋白濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,槲皮素處理細(xì)胞48 h,不同濃度組HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制(見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步采用流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示與0 μmol/L相比,各濃度槲皮素組的細(xì)胞凋亡率明顯上升,且凋亡率隨著槲皮素濃度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組凋亡率分別為 (4.61±0.76)%,(9.47±0.54)%,(14.78±0.93)%,(23.34±1.96)%,各組之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見(jiàn)圖2)。

圖1 不同濃度槲皮素處理的HeLa細(xì)胞形態(tài)觀察Figure 1 Morphology of HeLa cells in different treatment groups

圖2 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 (n=3)Figure 2 Effect of quercetin on apoptosis of HeLa cells (n=3)

2.2 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細(xì)胞48 h,HeLa細(xì)胞遷移受到明顯抑制,且遷移數(shù)隨著槲皮素濃度的升高而減少。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為(104.67±5.03)個(gè),(94.00±3.46)個(gè),(75.00±9.54)個(gè),(55.67±4.62)個(gè)。各組之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見(jiàn)圖3)。

圖3 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響 (n=3)Figure 3 Effect of quercetin on migration of HeLa cells (n=3)

2.3 槲皮素對(duì)細(xì)胞表達(dá)ROS的影響

流式檢測(cè)ROS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細(xì)胞48 h,HeLa細(xì)胞中ROS表達(dá)增加,且隨著槲皮素濃度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組的ROS表達(dá)量(DCFH-DA熒光強(qiáng)度)分別為65 402.00±886.87,76 497.00±9 648.64,95 774.66±3 440.82,106 135.00±3 724.35。各組之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見(jiàn)圖4)。

圖4 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞ROS表達(dá)的影響 (n=3)Figure 4 Effect of quercetin on the expression of ROS in HeLa cells (n=3)

2.4 槲皮素對(duì)細(xì)胞表達(dá)MDA的影響

試劑盒檢測(cè)細(xì)胞MDA含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細(xì)胞48 h,HeLa細(xì)胞中MDA表達(dá)增加,且隨著槲皮素濃度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組MDA含量分別為(1.85±0.06)nmol/mg,(2.52±0.22)nmol/mg,(3.50±0.24)nmol/mg,(4.19±0.43)nmol/mg。各組之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見(jiàn)圖5)。

與0 μmol/L相比,* P <0.05;與20 μmol/L相比,#P <0.05;與40 μmol/L相比,&P <0.05圖5 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞MDA含量的影響 (n=3)Figure 5 Effect of quercetin on the content of MDA in HeLa cells (n=3)

2.5 槲皮素對(duì)細(xì)胞SOD活力的影響

試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總SOD活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細(xì)胞48 h,HeLa細(xì)胞中SOD活力下降,且隨著槲皮素濃度的升高而下降。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組的總SOD活力分別為(75.28±0.39)U/mg,(62.84±3.76)U/mg,(52.61±1.51)U/mg,(35.52±3.72)U/mg。各組之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見(jiàn)圖6)。

與0 μmol/L相比,* P <0.05;與20 μmol/L相比,#P <0.05;與40 μmol/L相比,&P <0.05圖6 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞SOD活力的影響 (n=3)Figure 6 Effect of quercetin on the activity of total SOD in HeLa cells (n=3)

3 討論

宮頸癌是常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率及死亡率較高,且年輕化趨勢(shì)明顯,嚴(yán)重危害廣大婦女的健康和生命[1,11]。目前宮頸癌的治療手段以手術(shù)為主、放化療為輔,但治療效果不理想,副作用較多,預(yù)后率低,費(fèi)用較高,因此尋找放化療中毒副作用小且療效確切的輔助藥物成為研究熱點(diǎn)[12]。據(jù)報(bào)道,槲皮素在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌活性,如乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病等[6-8]。國(guó)內(nèi)外研究也認(rèn)為槲皮素具有治療宮頸癌的生物學(xué)活性[7]。癌細(xì)胞具有無(wú)限增殖的特點(diǎn),大量研究結(jié)果提示,槲皮素可不同程度地抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖,且呈時(shí)間和濃度依賴性[13,14]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡,維持細(xì)胞的健康生存和死亡平衡。凋亡信號(hào)有助于保護(hù)基因組的完整性,而凋亡缺陷可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)多種分子機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡并獲得對(duì)凋亡因子的抗性[15]。細(xì)胞凋亡是腫瘤治療中的關(guān)注要點(diǎn),很多抗癌藥物是通過(guò)誘導(dǎo)各自敏感的細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[16]。有研究表明,槲皮素可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡[17-19],本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的槲皮素作用于HeLa細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化,也提示細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而增加。此外,腫瘤細(xì)胞的侵襲力與癌癥發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān),本研究還利用穿透小室Transwell法檢測(cè)了HeLa細(xì)胞遷移能力,結(jié)果提示槲皮素可以抑制細(xì)胞的遷移能力,且呈濃度依賴性,與既往報(bào)道采用其他研究方法得出的結(jié)果相符[19,20]。結(jié)合本研究結(jié)果,認(rèn)為槲皮素的抗癌活性主要與其抑制癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[6,8]。此外,據(jù)報(bào)道槲皮素與化療藥物聯(lián)用能起到化療增敏作用,并有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多重耐藥性[21],這可能是槲皮素發(fā)揮抗癌作用的另一機(jī)制。

機(jī)體在遭受外界各種有害刺激的時(shí)候,會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生大量的高活性分子,如ROS,以應(yīng)對(duì)外界對(duì)組織和細(xì)胞造成的損傷。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的ROS自由基過(guò)多,超出機(jī)體的清除能力,進(jìn)而引起氧化與抗氧化之間失衡的病態(tài)生理現(xiàn)象被稱為氧化應(yīng)激。機(jī)體存在兩類(lèi)抗氧化系統(tǒng),其中一類(lèi)是抗氧化酶系統(tǒng),包括SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等,另一類(lèi)是非酶抗氧化系統(tǒng),由許多具有抗氧化能力的非酶類(lèi)物質(zhì)組成。以上抗氧化系統(tǒng)協(xié)同負(fù)責(zé)將ROS從高活性的自由基轉(zhuǎn)化成低活性分子,從而阻止ROS轉(zhuǎn)化成更具危害性的物質(zhì),降低對(duì)細(xì)胞的氧化損傷[22,23]。以槲皮素為代表的天然抗氧化功能因子具有清除自由基及上調(diào)機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)活性的作用,對(duì)機(jī)體氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)有積極意義[24]。但隨著研究的深入,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)包括槲皮素在內(nèi)的部分黃酮類(lèi)化合物,在高濃度、長(zhǎng)時(shí)間作用時(shí)發(fā)揮促氧化作用,會(huì)造成機(jī)體ROS水平升高,抗氧化酶活性下降等。槲皮素清除自由基的中間產(chǎn)物具有生物毒性,可能是導(dǎo)致其促氧化作用出現(xiàn)的原因之一[25,26]。

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,涉及多條信號(hào)通路的交互作用,因此尋找可靠的抗癌靶點(diǎn)以及明確抗癌藥物的作用機(jī)制意義重大。ROS等自由基誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激與人體多種慢性疾病,包括癌癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[27]。除ROS外,在氧化應(yīng)激過(guò)程中的丙二醛(MDA)是ROS與細(xì)胞膜磷脂的不飽和脂肪酸反應(yīng)形成的物質(zhì),是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的一個(gè)非常重要的指標(biāo)。對(duì)SOD的檢測(cè)和評(píng)價(jià)是作為氧化應(yīng)激和抗氧化最常用的另一指標(biāo)[28]。在絕大多數(shù)情況下,槲皮素具有抗氧化活性[6]。為了明確槲皮素對(duì)宮頸癌中氧化應(yīng)激的影響,本研究檢測(cè)了各組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量以及T-SOD活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 μmol/L及以上濃度的槲皮素處理細(xì)胞48 h,可以明顯上調(diào)ROS、MDA水平,降低T-SOD活力,說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)條件下槲皮素對(duì)正常HeLa細(xì)胞發(fā)揮促氧化作用。以上研究結(jié)果與在肝癌中的研究結(jié)果類(lèi)似[29],證實(shí)高濃度槲皮素作用時(shí)間長(zhǎng)時(shí)可發(fā)揮明顯的促氧化效應(yīng)。由于槲皮素能明顯誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡,而ROS的增多與細(xì)胞凋亡有關(guān)[19,30],我們推測(cè)槲皮素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與其促氧化效應(yīng)有關(guān)。

綜上所述,本研究提示槲皮素能夠通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng),且呈劑量依賴性,其機(jī)制可能與槲皮素促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)。不過(guò),槲皮素對(duì)HeLa的作用是否與促氧化直接相關(guān),二者之間的因果關(guān)系如何還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全反映體內(nèi)真實(shí)情況,還有待于在宮頸癌動(dòng)物模型甚至患者中進(jìn)行觀察,為將槲皮素用于宮頸癌的臨床治療提供理論依據(jù)。