付 彩,崔小芳,裴香萍,杜晨暉,閆 艷*

(1 山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2 山西中醫(yī)藥大學中藥學院;*通訊作者,E-mail:yanyan520@sxu.edu.cn)

酸棗葉(ZiziphiSpinosaeFolium)為鼠李科棗屬植物酸棗(ZiziphusjujubaMill. Var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou)的干燥葉。始載于《本草綱目》,又名棘葉,具有“斂瘡解毒,治脛臁瘡”之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明,酸棗葉具有明顯的鎮(zhèn)靜安神[2]、抗氧化[3]、保護肝臟[4]等多種保健功效?；瘜W成分研究表明酸棗葉中含有豐富的黃酮[5]、皂苷[6]、氨基酸[7]、核苷[8]、微量元素[9]等營養(yǎng)成分。課題組前期采用紫外分光光度法測定山西省9個不同產(chǎn)地的酸棗葉樣品中總黃酮的含量,發(fā)現(xiàn)山西晉中地區(qū)酸棗葉總黃酮含量最高且可達8%[5];采用超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive)與高效液相色譜-化學發(fā)光(HPLC-CL)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)酸棗葉中多以槲皮素和山奈酚為母核的黃酮為主,且能在線清除過氧化氫和超氧陰離子自由基[10]。為此我們優(yōu)化了酸棗葉總黃酮的提取純化工藝,富集了純度為41.5%的總黃酮部位[11]。為了對提取純化的酸棗葉總黃酮進行質(zhì)量控制,本文將建立一種靈敏、高效、準確度高的含量測定方法。

超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-QTRAP-MS)技術(shù)是研究中藥復雜成分的一種有效、可行的分析方法。傳統(tǒng)的多反應監(jiān)測掃描(mmultiple reaction monitoring,MRM)是定量分析的“金標準”;而線性離子阱的增強子離子掃描模式(enhanced product ion scanning,EPI)可獲得相應的二級碎片,在化合物定量的同時起到定性的作用[12]。基于數(shù)據(jù)依賴性獲取(information dependent acquisition,IDA)時,可實現(xiàn)多反應監(jiān)測-觸發(fā)增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI),實現(xiàn)一次進樣同時獲得高靈敏度MRM的定量數(shù)據(jù)和二級全掃描質(zhì)譜圖進行定性確認。在不降低定性和定量分析性能的同時,既能實現(xiàn)高靈敏地定性鑒定化合物,又能在一次運行中準確定量特定目標化合物[13-15]。

本實驗采用基于MRM-IDA-EPI模式的液質(zhì)聯(lián)用方法(LC-MS/MS)對酸棗葉總黃酮中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素6種化學成分進行鑒定,同時對以上化合物進行含量測定,為后期藥效學及藥動學研究提供實驗基礎(chǔ),同時將為酸棗葉總黃酮的開發(fā)利用提供合理的科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1290Ⅱ超高效液相色譜儀,配有G7120A四元泵,G7116B柱溫箱,G7167B自動進樣器(美國Agilent公司);3200 QTRAP三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀,配有ESI離子源,Analyst 1.5.2 software數(shù)據(jù)系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司);Neofuge13R高速冷凍離心機(中國力康公司);CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

對照品槲皮素-3-O-洋槐糖苷(批號:20161227)、蘆丁(批號C1424058)、金絲桃苷(批號:20161022)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(批號:HI105405198)、槲皮苷(批號:20160830)均購自寶雞辰光生物科技有限公司。槲皮素(批號:Q111274)購自阿拉丁試劑有限公司。經(jīng)HPLC歸一化法測定對照品的質(zhì)量分數(shù)均大于98%。甲醇、乙腈和甲酸為色譜純,購自美國Thermo Fisher公司。超純水由Milli-Q制備,其余試劑均為分析純。

酸棗葉2017年10月采自山西省晉中市(樣品編號:20170627004),經(jīng)山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室杜晨暉副教授鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubeMill. var.spinosa(Bunge) Huex H. F.Chou的干燥葉子。留樣于山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。酸棗葉經(jīng)AB-8型大孔樹脂純化得總黃酮部位,得率為10%,純度為41.5%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相為乙腈(A)-水(B)(含有0.1%甲酸);梯度洗脫條件:0-5 min 15%A,5-13 min 15%-16%A,13-17 min 16%A,17-20 min 16%-16.5%A,20-24 min 16.5%-100%A;流速為0.3 ml/min;柱溫35 ℃;進樣量2 μl。對照品和樣品的MRM色譜圖見圖1。

左邊一列為對照品,右邊為酸棗葉總黃酮樣品;1.槲皮素-3-O-洋槐糖苷;2.蘆丁;3.金絲桃苷;4.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;5.槲皮苷;6.槲皮素圖1 對照品和酸棗葉總黃酮樣品的MRM色譜圖Figure 1 The representative MRM chromatograms of standard solution and Ziziphi Spinosae Folium sample

2.2 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:MRM負離子掃描;源噴射電壓(IS)為-4 500 V;霧化溫度:550 ℃;氣簾氣(Curtain gas,N2):40.0 psi;霧化氣(GS1,N2):50 psi;輔助氣(GS2,N2):50 psi。全掃面模式下針泵進樣6種指標成分對照品質(zhì)譜參數(shù)見表1,從中選擇出的6個定量離子見表2。

表1 全掃面模式下針泵進樣6種成分的離子碎片Table 1 Full-scan model and the proposed fragmentation schemes of six components

表2 6種成分的保留時間和質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Retention time and MS parameters of the six components

MRM-IDA-EPI模式:IDA參數(shù),select 1 to 1 most intense peaks;選擇動態(tài)背景扣除(alter dynamic background subtraction of survey scan);閾值(which exceeds),500 cps。

EPI參數(shù)設置為掃描范圍:50-650;掃描速率(scan rate):1 000 Da/s;離子阱動態(tài)填充(dynamic fill time);DP:-80 eV;EP:-10 eV;CES:(-45±15)eV。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取對照品適量,精密稱定,加70%的甲醇制備成槲皮素-3-O-洋槐糖苷和蘆丁濃度為1 mg/ml的單一對照品儲備液,加70%的甲醇制備成金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷和槲皮素濃度均為0.02 mg/ml的單一對照品溶液。分別精密吸取上述對照品儲備液,適量加甲醇制成濃度分別為50,52.8,0.544,1.034,1.014,0.148 μg/ml的混合對照品儲備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取酸棗葉總黃酮粉末約10 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加70%甲醇25 ml,稱定質(zhì)量,超聲提取20 min。放置室溫,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補足減失質(zhì)量,0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 定性分析

按“2.1”和“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件,分別對樣品中6個化合物進行EPI參數(shù)的優(yōu)化,獲得高質(zhì)量的二級碎片信息(見圖2)。以蘆丁為例,參考文獻[16]發(fā)現(xiàn),在負離子模式下,丟失蕓香糖形成特征離子碎片301,碎片301繼續(xù)裂解形成碎片273.0,255.1,179.0,151.0等。通過與對照品針泵進樣離子碎片和文獻[10]比較,其他5個化合物分別被鑒定為:槲皮素-3-O-洋槐糖苷、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素。

圖2 MRM-IDA-EPI模式下酸棗葉總黃酮6種化合物的EPI圖譜Figure 2 EPI spectra for six components in Ziziphi Spinosae Folium based on MRM-IDA-EPI mode

由此可見,MRM-IDA-EPI模式與常見的三重四級桿掃描模式相比,增強了二級碎片離子掃描,使定性、定量分析更準確。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關(guān)系、定量限和檢測限 精密量取上述混合對照品溶液適量,用70%甲醇逐級稀釋7個濃度梯度的混合對照品溶液。按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件分析,以指標成分的峰面積為縱坐標(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(X),進行線性回歸,得回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍,結(jié)果6種指標成分的質(zhì)量濃度和峰面積的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 5,表明該方法線性關(guān)系良好。將混合對照品溶液按照質(zhì)量濃度梯度由高到低稀釋,分別以信噪比S/N=10和S/N=3時各對照品的量作為定量限(LOD)和檢測限(LOD),結(jié)果見表3。

表3 6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOQ和LODTable 3 Regression equations, correlation coefficients and linearity ranges of the six components

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件同一天內(nèi)連續(xù)進樣6次,記錄6種指標成分的峰面積,并計算其峰面積的RSD值。連續(xù)3 d,每天精密吸取上述混合對照品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件同一天內(nèi)連續(xù)進樣3次,記錄6種指標成分3 d的峰面積,并計算其峰面積的RSD值。結(jié)果顯示,6個化合物的RSD值均小于3%(見表4),表明儀器的日間精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批酸棗葉總黃酮粉末樣品,約10 mg,精密稱定,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,于室溫放置0,2,4,6,12,24 h后按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣分析,以峰面積為指標進行分析,計算6種指標成分峰面積的RSD值,結(jié)果顯示,6個化合物的RSD值均小于3%(見表4),表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗 取同一批酸棗葉總黃酮樣品粉末6份,每份約10 mg,精密稱定,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣分析,分別記錄6種指標成分的峰面積,計算其質(zhì)量分數(shù)及其RSD值。6份樣品中槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素的含量依次為10.4%,8.3%,0.1%,0.3%,0.2%,0.005%,其RSD見表4,符合藥典規(guī)定要求,表明樣品提取方法的精密度良好。

表4 6種成分的精密度、重復性、穩(wěn)定性Table 4 Stability, precision and repeatability of the six components

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知6個成分含量的酸棗葉總黃酮樣品6份,每份約5 mg,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別精密加入相當于5 mg樣品中6種成分含量50%、100%、150%的混合對照品溶液,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣分析,記錄指標成分的峰面積,計算其平均加樣回收率及相應的RSD值。由表5可知,6種化合物的回收率在99%-108%的范圍內(nèi),且RSD值均小于3%,表明提取方法的準確度良好。

表5 6種成分的加樣回收率Table 5 Recovery of the six components

2.5.6 樣品測定 分別取待測的酸棗葉總黃酮樣品3份,每份約10 mg,精密稱定,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣分析,記錄指標成分的峰面積,計算6種指標成分的含量。3份樣品中,槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素的平均含量分別為10.4%,8.3%,0.1%,0.3%,0.2%,0.005%(相當于酸棗葉總黃酮質(zhì)量)。

3 討論

本文建立了一種基于MRM-IDA-EPI模式的液質(zhì)聯(lián)用方法同時測定酸棗葉總黃酮含量的方法,并采用數(shù)據(jù)依賴掃描模式獲得每個化合物的二級質(zhì)譜信息,對化合物進行鑒別表征?，F(xiàn)有的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法多采用多反應監(jiān)測(MRM)掃描方式進行定性與定量檢測,MRM檢測靈敏度高、定量準確,但在定性的準確程度上依靠兩離子對的豐度比進行最終確認不夠嚴謹,檢測中易出現(xiàn)假陽性峰干擾判斷[17]。本文采用在MRM掃描方式下進一步聯(lián)合EPI掃描可以在較低濃度條件下生成二級子離子全掃描圖,同時定性定量分析。

酸棗葉總黃酮中含有大量的同分異構(gòu)體,色譜條件直接影響到被分析化合物的分離效能。首先對流動相組成進行考察,在水相中分別加入0.1%和1%的甲酸,結(jié)果表明流動相中含有0.1%的甲酸時色譜峰的離子響應最大。此外,分別比較了ACQUITY UPLC?BEH C18,Atlantis?T3及ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱,結(jié)果表明ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱對黃酮類成分的分離效果最好。

本實驗針泵進樣優(yōu)化MRM條件,分別對6個化合物的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)進行優(yōu)化,得到6個母離子和子離子離子對。當MRM信號低于IDA設定的閾值500 cps時,只進行MRM掃描;當MRM信號大于IDA設定的閾值500 cps時同時啟動線性離子阱的EPI功能。為了得到豐富的二級碎片信息,繼而對EPI參數(shù)進行優(yōu)化,結(jié)果表明,當EPI中DP為80、CES為(40±15)eV時,6個化合物的碎片離子最豐富。含量測定結(jié)果表明,槲皮素-3-O-洋槐糖苷與蘆丁這一對同分異構(gòu)體為酸棗葉總黃酮的主要成分,兩者的含量占總黃酮的19.35%。槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、金絲桃苷的含量相對較低,均小于0.3%,而槲皮素的含量最低為0.005%。由此可見,酸棗葉總黃酮以糖苷類成分為主,而這6種糖苷類成分均具有較強的抗氧化活性[18]。值得注意的是有報道研究槲皮素糖苷類化合物如槲皮苷等對H2O2和紫外(UV)損傷造成的人胚皮膚成纖維細胞(ESF-1)細胞衰老具有良好的保護作用[19]。而且在本次實驗中含量高的蘆丁也被報道可以通過抗氧化機制延緩D-半乳糖造成的大鼠的氧化衰老[20]。

基于以上分析,提示酸棗葉總黃酮可能具有延緩衰老的作用,有待進一步研究。酸棗葉總黃酮有望成為一種新型綠色的、可持續(xù)的抗氧化資源;有望開發(fā)為具有抗氧化、抗衰老功能的健康產(chǎn)品。同時本研究為后期的藥效學及藥動學研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量保證。