蔡 鑫,熊 蓉,范佳楊,湯亞蘭,劉 康,劉先平,岳秋菊,梁 婷,羅岳西*

(1 川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院,南充市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,南充 637000;2 南充市中心醫(yī)院,川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所;3 腫瘤生物治療南充市重點實驗室;*通訊作者,E-mail:2717378119@qq.com)

宮頸癌是女性中僅次于乳腺癌的常見惡性腫瘤,其發(fā)病率已成為女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[1,2]。在我國,每年宮頸癌新增患者大約在13萬,在世界的年發(fā)病總數(shù)中,中國約占1/4,且其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢[3-5]。從正常的宮頸上皮、到宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN),直至宮頸癌是一個多基因、多因素、多階段相互作用的結(jié)果[6-8]。進(jìn)一步探索宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,從而研究新的治療手段和方法,對進(jìn)一步提高宮頸癌的療效具有重要意義。

α-烯醇化酶(alpha-enolase enzyme,ENO1)是烯醇化酶家族中3種同功酶之一,是糖酵解過程的限速酶[9]。近年的研究發(fā)現(xiàn),ENO1在細(xì)胞定位和生物學(xué)功能方面具有多樣性[9-11],參與轉(zhuǎn)錄、凋亡的調(diào)控及細(xì)胞分化等過程,已證實其在肺癌、鼻咽癌、胃癌等惡性腫瘤的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,阻斷其表達(dá)可抑制相關(guān)腫瘤細(xì)胞生長[12-15]。但ENO1與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸關(guān)系如何,目前國內(nèi)外報道很少。本研究旨在探討ENO1在宮頸癌的表達(dá)及沉默該基因后對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,為宮頸癌診治開拓新的靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

選取2016-01～2016-12南充市中心醫(yī)院病理科的存檔標(biāo)本(宮頸癌組織及癌旁組織)48例,收集標(biāo)本時,所有患者均未接受放療、化療,臨床資料完整。所有患者均在我院行廣泛子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),術(shù)后病理診斷為宮頸癌,其中鱗癌44例,腺癌4例。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期25例(ⅠB1期6例,ⅠB2期19例),ⅡA期23例;高分化20例,中分化23例,低分化5例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。48例患者年齡43-75歲,平均60歲。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株和質(zhì)粒

HeLa細(xì)胞株購自上海拜力生物科技有限公司,ENO1 shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒GV102-shENO1和陰性對照質(zhì)粒GV102根據(jù)參考文獻(xiàn)構(gòu)建并由上海吉凱基因公司合成和驗證。針對ENO1基因靶序列設(shè)計的編碼shRNA的兩條寡核苷酸序列見表1。

表1 sh-ENO1基因序列Table 1 Sequence of sh-ENO1

1.3 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司,RPMI-1640、胎牛血清購自Hyclone公司,ENO1 shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒GV102-shENO1和陰性對照質(zhì)粒GV102由上海吉凱基因公司合成,RT-PCR引物和qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,質(zhì)粒提取試劑盒和RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司,cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自Thermo公司,Transwell小室購自Conring公司,MatrigelTM購自BD公司,結(jié)晶紫購自Sigma公司,脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司,兔抗人ENO1多克隆抗體購自Santa Cruze公司。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶連接法(S-P法)按試劑盒說明書進(jìn)行操作。切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精水化后,雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性后高壓鍋行抗原修復(fù)10 min,正常山羊血清封閉20 min后,滴加一抗(以PBS代替一抗作為陰性對照)4 ℃孵育過夜,PBS洗2遍,滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,PBS洗2遍后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉軟白素工作液,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。ENO1陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。結(jié)果判定在雙盲法下進(jìn)行,每張切片由2名病理醫(yī)師分別判斷,兩者結(jié)論不一致時重新評判。

1.5 qRT-PCR檢測宮頸癌和癌旁組織ENO1 mRNA表達(dá)水平

按照Omega RNA提取試劑盒說明書分別提取宮頸癌組織和癌旁組織RNA,按cDNA合成試劑盒說明書分別將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后按照Bio-Rad熒光定量試劑盒說明書加樣檢測不同組織ENO1表達(dá)差異。qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程工程有限公司合成,引物序列見表2。所有反應(yīng)均設(shè)有3個復(fù)孔,采用SYBR Green嵌合熒光方法在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。

表2 PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度Table 2 The primer sequence and amplified fragment length of PCR

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

實驗分為對照組(PBS組)、空載體組(GV102組)和干擾組(shENO1組)。將復(fù)蘇的HeLa細(xì)胞于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用0.25%胰酶消化后鋪于6孔板中,按照Lipofectamine 2000說明書將GV102-shENO1、GV102分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h更換含700 μg/ml G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞2周,挑取陽性克隆繼續(xù)在含350 μg/ml G418的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.7 RT-PCR檢測細(xì)胞中ENO1 mRNA水平

設(shè)計ENO1上、下游引物見表1。用RNA提取試劑盒提取3組細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增片段大小為785 bp,擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μl 6×上樣緩沖液,均勻混合后在2%瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物。紫外凝膠成像分析系統(tǒng)顯帶、拍照。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞中ENO1蛋白水平

分別提取3組細(xì)胞總蛋白,取30 μg總蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉后分別加入一抗、二抗孵育,電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,經(jīng)曝光、顯影、定影后照相,以β-actin為內(nèi)參,觀察各組ENO1蛋白的表達(dá)情況。

1.9 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24,48,72,96 h后,每孔加入20 μl MTT溶液,37 ℃繼續(xù)孵育4 h,小心吸棄上清,每孔加入200 μl DMSO,避光震蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測OD值,繪制細(xì)胞生長曲線。

1.10 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移

取3組細(xì)胞分別種植于6孔板中,用200 μl移液槍頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕,0 h和24 h后顯微鏡下隨機(jī)選擇5個100倍視野拍照并測量劃痕寬度,計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(1-測量時劃痕寬度/初始劃痕寬度)×100%。

1.11 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲

24孔板Transwell小室下室加入600 μl 1640培養(yǎng)基,聚碳酸酯微孔濾膜上均勻鋪1 μg/μl人工基底膜膠Matrigel 50 μl,37 ℃孵育30 min。取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞消化后制成1×106/ml的單細(xì)胞懸液,分別加入100 μl(1×105)至Transwell上室,37 ℃孵育24 h后,吸取上室液體,濕棉簽擦去膜表面未侵襲的細(xì)胞,甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色,隨機(jī)計數(shù)5個200倍視野下的穿膜細(xì)胞數(shù),取平均值。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理、分析,計量資料采用t檢驗分析比較組間差異,計數(shù)資料采用χ2檢驗和秩和檢驗比較組間差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ENO1蛋白在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)

ENO1定位于細(xì)胞核,呈淡黃色至棕黃、棕褐色,在宮頸癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織中的表達(dá)(宮頸癌組織ENO1陽性率為97.9%,癌旁組織ENO1陽性率為31.25%,P<0.001,見圖1)。

圖1 ENO1在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)情況 (×200)Figure 1 Expression of ENO1 in cervical cancer and adjacent tissues (×200)

2.2 ENO1表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

ENO1蛋白表達(dá)與患者年齡、FIGO分期、病理類型和分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05,見表3)。

表3 ENO1與宮頸癌臨床病理特征相關(guān)性分析Table 3 Correlation between ENO1 expression and clinicopathological features in cervical cancer patients

2.3 ENO1基因在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)

據(jù)qRT-PCR結(jié)果顯示,ENO1基因在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01,見圖2)。

2.4 RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞中ENO1的表達(dá)

RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果和Western blot檢測結(jié)果顯示,與GV102組和PBS組比較,shENO1組細(xì)胞內(nèi)ENO1 mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平顯著下調(diào),而GV102組和PBS組細(xì)胞內(nèi)ENO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著差異(見圖3,4)。表明所構(gòu)建的GV102-shENO1載體顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ENO1的表達(dá)。

與癌旁組織相比,* * P <0.01圖2 qRT-PCR檢測ENO1基因在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)情況Figure 2 The expression of ENO1 mRNA in cervical cancer and paracancerous tissues detected by qRT PCR

圖3 RT-PCR檢測各組細(xì)胞ENO1 mRNA表達(dá)情況Figure 3 The expression of ENO1 mRNA detected by RT-PCR

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞ENO1蛋白表達(dá)情況Figure 4 The expression of ENO1 protein detected by Western blot

2.5 ENO1對HeLa細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞生長24,48,72和96 hshENO1組吸光度值(分別為0.42±0.05,0.48±0.07,0.62±0.09,0.65±0.02)均低于PBS組(分別為0.70±0.04,0.79±0.07,1.12±0.09,1.18±0.06)和GV102組(分別為0.69±0.07,0.74±0.04,1.18±0.15,1.21±0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PBS組和GV102組比較生長無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,見圖5)。

圖5 MTT檢測HeLa細(xì)胞生長增殖情況Figure 5 The proliferation abilities of HeLa cells detected by MTT

2.6 ENO1對HeLa細(xì)胞遷移的影響

觀察24 h后,shENO1組細(xì)胞遷移率顯著低于PBS組和GV102組(31%±4%vs83%±4%,81%±5%,P<0.05),而PBS組和GV102組的細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖6)。

圖6 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 (×100)Figure 6 The migration abilities of HeLa cells detected by scratch test (×100)

2.7 ENO1對HeLa細(xì)胞侵襲的影響

觀察24 h后,PBS組和GV102組平均視野侵襲細(xì)胞數(shù)為(85.48±9.93)個、(79.63±9.42)個,而shENO1組平均視野侵襲細(xì)胞數(shù)為(23.54±6.22)個,與PBS組比較侵襲能力下降了約72.46%,與GV102組比較侵襲能力下降了70.44%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖7)。

圖7 Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲能力 (×200)Figure 7 The invasive abilities of HeLa cells detected by Transwell (×200)

3 討論

宮頸癌是女性腫瘤性疾病中導(dǎo)致死亡的第二病因,每年全球約有50萬例患者被診斷為宮頸癌,其中約40萬例發(fā)生在發(fā)展中國家[2]。傳統(tǒng)的治療方法以手術(shù)、放化療為主[16,17],但均存在一定的局限性和副反應(yīng)的發(fā)生。近年的研究表明,宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個極其復(fù)雜的多階段多基因調(diào)控異常的過程[18-20],因此,人們嘗試從基因水平對其進(jìn)行治療,初步臨床研究結(jié)果已經(jīng)顯示了其良好的應(yīng)用前景[21-23]。

ENO1作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,其基因的表達(dá)及在細(xì)胞中的定位對腫瘤的影響非常重要,根據(jù)Warburg等[24]的觀點,近年通過靶向糖代謝途徑中的一個或多個關(guān)鍵酶或其他分子來治療惡性腫瘤的策略備受關(guān)注。研究表明,ENO1在肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)[13-15,25]。國內(nèi)有學(xué)者曾探討慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌三組病變中ENO1蛋白的表達(dá)差異,結(jié)果顯示ENO1的表達(dá)依次增強(qiáng),蛋白定位則由胞質(zhì)胞核逐漸轉(zhuǎn)移至胞質(zhì),提示ENO1可能參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程[26,27]。我們通過免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR檢測顯示,ENO1基因和蛋白在宮頸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá),其表達(dá)與患者年齡、FIGO分期、病理類型和分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征無顯著差異,與已有報道結(jié)果一致。

為進(jìn)一步驗證ENO1與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,我們利用RNA干擾技術(shù)沉默宮頸癌HeLa細(xì)胞中ENO1基因的表達(dá),觀察其對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。本實驗中,我們首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將構(gòu)建的針對ENO1 mRNA的shRNA干擾片段轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR和Western blot證實ENO1基因表達(dá)受到顯著抑制,能滿足進(jìn)一步的實驗要求。通過MTT檢測96 h的連續(xù)觀察及比較,我們發(fā)現(xiàn)ENO1沉默明顯降低了宮頸癌細(xì)胞的增殖能力。劃痕實驗結(jié)果顯示,RNA干擾ENO1基因的表達(dá)后,HeLa細(xì)胞的遷移率顯著降低。Transwell實驗檢測干擾后細(xì)胞侵襲能力結(jié)果顯示,ENO1基因沉默后宮頸癌細(xì)胞穿膜數(shù)明顯減少。細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲受多個信號通路的影響,ENO1基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長侵襲的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[9,28-31]。

總之,本研究結(jié)果表明,ENO1是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個促進(jìn)因素,其直接或間接參與了宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為。隨著對ENO1研究的不斷深入,將對探討宮頸癌發(fā)病機(jī)制、判斷預(yù)后及治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義,靶向抑制ENO1有望成為包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤治療的新手段。