程忠強(qiáng),蔣成義,詹曉東

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,蚌埠 233003;*通訊作者,E-mail:zxdent2007@aliyun.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一,發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。NPC早期癥狀不明顯,但其惡性程度高,早期可發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,約70%患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期,多預(yù)后差[1,2]。目前臨床治療NPC多以手術(shù)切除結(jié)合放療和(或)輔助化療為主,但大多患者對(duì)放療中度敏感且會(huì)引起全身后遺癥,而約75%患者會(huì)出現(xiàn)化療耐藥性,臨床效果不佳[3,4],因此急需尋找新型治療藥物。木犀草素(luteolin,LUT)是一種天然的四羥基黃酮化合物,在多種藥用植物中廣泛存在,具有消炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性,在結(jié)腸癌[5]、肝癌[6]、乳腺癌[7]等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用,但對(duì)NPC的作用尚少有研究。研究發(fā)現(xiàn)[8-10],磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(PI3K)通路與NPC高分化細(xì)胞株CNE-1增殖、遷移和侵襲密切相關(guān),而腫瘤侵襲、遷移過(guò)程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)機(jī)制又發(fā)揮重要作用。基于此,本研究擬通過(guò)探究LUT靶向PI3K通路對(duì)NPC CNE-1細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響,以期揭示其作用機(jī)制,為臨床治療NPC的新藥開(kāi)發(fā)研究提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑及儀器

人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);木犀草素(luteolin,LUT,貨號(hào):491-70-3)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào):21870084)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,貨號(hào):10099141C)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MTT試劑盒(貨號(hào):11465007001)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;蛋白抽提試劑盒(貨號(hào):P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào):P0010S)、PI3K通路抑制劑LY294002(貨號(hào):S1737)購(gòu)自上海碧云天公司;鼠源一抗anti-PI3K p85(貨號(hào):MA5-32917)、anti-AKT(貨號(hào):AHO1112)、anti-E-cadherin(貨號(hào):33-4000)、anti-Vimentin(貨號(hào):MA5-11883)、anti-GAPDH抗體(貨號(hào):AM4300),兔源anti-p-PI3K p85(貨號(hào):PA5-104853)、anti-p-AKT(貨號(hào):MA5-14916)抗體,二抗羊抗鼠IgG(貨號(hào):A-11001)、羊抗兔IgG(貨號(hào):A-11008)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;鼠源一抗anti-MMP-2(貨號(hào):ab86607)、anti-MMP-9(貨號(hào):ab11906)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Evolution 220紫外分光光度計(jì)、FC酶標(biāo)儀、Forma Steri-Cycle i160 5%CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇CNE-1細(xì)胞后,置于10% FBS、1%青鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代,用0.25%胰蛋白酶消化處理。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)CNE-1細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,以細(xì)胞密度為3×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞板,分別添加LUT使其終濃度為20,40,60 μmol/ml,設(shè)為L(zhǎng)UT低劑量組(LUT-L組)、中劑量組(LUT-M組)、高劑量組(LUT-H組),另設(shè)置在LUT低劑量基礎(chǔ)上添加PI3K通路抑制劑LY294002 1 μmol/ml為L(zhǎng)Y294002組,同時(shí)設(shè)正常培養(yǎng)CNE-1細(xì)胞為正常對(duì)照組(NC組),均培養(yǎng)48 h,每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后采用MTT試劑盒檢測(cè)各組CNE-1細(xì)胞存活率,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組/ODNC組)×100%。

1.2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)CNE-1細(xì)胞調(diào)整濃度為1×106個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞板,細(xì)胞分組同1.2.2。培養(yǎng)結(jié)束收集各組CNE-1細(xì)胞,調(diào)整濃度至1×105個(gè)/ml,取200 μl分別接種于鋪有或無(wú)matrigel膠的Transwell板小室中培養(yǎng)24 h后,90%乙醇固定,0.1%結(jié)晶紫常溫染色后,于倒置顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù),每張膜中央及周圍部分各隨機(jī)取5個(gè)視野,分別計(jì)算穿過(guò)聚碳酸酯膜微孔的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 免疫印跡(Western blot)檢測(cè)PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9、E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá) 提取各組CNE-1細(xì)胞總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,具體操作參照蛋白提取試劑盒,蛋白樣品置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉,分別添加一抗anti-PI3K(1 ∶1 000)、anti-p-PI3K(1 ∶500)、anti-AKT(1 ∶500)、anti-p-AKT(1 ∶500)、anti-基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)(1 ∶500)、anti-MMP-9(1 ∶1 000)、anti-鈣黏蛋白(E-cadherin)(1 ∶500)、anti-波形蛋白(vimentin)(1 ∶200)、anti-GAPDH(1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST緩沖液洗膜3次,添加二抗IgG(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜,顯色,曝片,觀察并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞存活率的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 各組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞存活率比較Table 1 Comparison of cell viability of nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.2 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見(jiàn)圖1、表2)。

圖1 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移的影響Figure 1 Effect of LUT on migration of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

表2 各組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移和侵襲比較Table 2 Comparison of migratory cells of nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.3 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞侵襲的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組、LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見(jiàn)圖2、表2)。

圖2 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞侵襲的影響Figure 2 Effect of LUT on invasion of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

2.4 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞PI3K通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見(jiàn)圖3、表3)。

圖3 Western blot檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of p-PI3K, PI3K, p-Akt and Akt proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表3 各組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比較Table 3 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt levels in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.5 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,圖4、表4)。

圖4 WB檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of MMP-2 and MMP-9 proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表4 各組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of MMP-2 and MMP-9 protein expression in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.6 LUT對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),而LY294002組低于LUT-H組(P<0.05);vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見(jiàn)圖5、表5)。

圖5 WB檢測(cè)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)Figure 5 Expression of E-cadherin and vimentin proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表5 各組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of E-cadherin and vimentin protein expression in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

3 討論

近來(lái),尋找安全、有效、副作用小的腫瘤化療替代藥物成為研究熱點(diǎn)之一。LUT是一種天然黃酮類化合物,多以糖苷形式存在于全葉青蘭、野菊花、金銀花、紫蘇等多種藥用植物中,具有鎮(zhèn)咳祛痰、消炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗腫瘤及抑制血管形成等多種作用[11,12]。Fan等[13]研究報(bào)道,黃酮類化合物L(fēng)UT可通過(guò)抑制Src/Stat3/S100A7信號(hào)通路抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌的遷移和侵襲。Yin等[14]研究報(bào)道,氰苷-3-O-葡萄糖苷與LUT協(xié)同抑制結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置LUT低、中、高濃度分別為20,40,60 μmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組和LUT-H組NCP CNE-1細(xì)胞存活率顯著降低,且呈劑量依賴性,提示LUT可抑制NCP CNE-1細(xì)胞增殖。

遷移、侵襲是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的惡質(zhì)性特征,也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、患者死亡的重要原因。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,本身具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性,Akt是其主要下游效應(yīng)分子,Akt活化是PI3K通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵步驟,PI3K/Akt通路廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞中,與其增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。李仕晟等[15]研究報(bào)道,針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的NPC靶向治療可逆轉(zhuǎn)EB病毒膜潛伏蛋白1(Epstein-Barr virus membrane latent protein 1,LMP1)誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)抵抗作用,抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可顯著提高CNE-1-LMP1細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。付銀鋒等[16]研究報(bào)道,LUT可抑制黑素瘤A375和B16F10細(xì)胞增殖、侵襲,誘導(dǎo)其凋亡,可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。鐘燁等[17]研究報(bào)道,LUT可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路下調(diào)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá),抑制侵襲和遷移能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低,而LY294002組均高于LUT-H組。MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,促進(jìn)其遷移、侵襲,以MMP-2、MMP-9蛋白研究居多,提示LUT可抑制NPC CNE-1細(xì)胞遷移、侵襲,可能與靶向抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

EMT是指上皮細(xì)胞到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,亦與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān)。其中細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白表達(dá)缺失及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)是其重要特征,也是腫瘤形成的關(guān)鍵步驟[18,19]。Yu等[20]研究報(bào)道,磷酸酶1核靶向亞基(phosphatase 1 nuclear-targeting subunit,PNUTS)通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、vimentin蛋白表達(dá)上調(diào),促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的NPC CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲和EMT。Chen等[21]研究報(bào)道,LUT通過(guò)干擾PI3K/Akt-NF-κB信號(hào)通路下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá),減弱TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT過(guò)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著增加,而LY294002組均低于LUT-H組;vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低,而LY294002組均高于LUT-H組。提示LUT可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)NPC CNE-1細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)和vimentin蛋白表達(dá)下調(diào),抑制其EMT過(guò)程。

綜上所述,LUT可能通過(guò)靶向抑制PI3K通路抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移、侵襲,抑制其EMT過(guò)程,該發(fā)現(xiàn)可對(duì)LUT在NPC臨床治療應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。但本研究?jī)H在細(xì)胞水平上證實(shí)LUT的抗NPC作用,存在不足,后期仍需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探究其安全劑量,以待更加明確其作用機(jī)制。